三株乳酸杆菌益生及免疫特性研究

试验以副干酪乳杆菌KLDS1.0351、植物乳杆菌KLDS1.0985及KLDS1.0986为对象,探究其耐人工胃液、肠液、耐胆盐能力及三株菌株对脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,三株菌株耐人工胃液、耐人工肠液和耐胆盐能力良好,副干酪乳杆菌KLDS1.0351强于植物乳杆菌KLDS1.0985和KLDS1.0986。乳酸杆菌对脾淋巴细胞活性的影响随活菌数量的增加而增大。活菌数为107 CFU/m L时,对脾淋巴细胞活性的影响为KLDS1.0986KLDS1.0351KLDS1.0985;KLDS1.0351对脾淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用,而KLDS1.0985和KLDS1.0986两株菌株只有活菌数达到107 CFU/m L时才有促进作用。     

植物乳杆菌KLDS1.0386联合色氨酸对溃疡性结肠炎的影响

为探究色氨酸的降解对溃疡性结肠炎是否存在预防效果,本文通过高效液相色谱方法测定植物乳杆菌发酵液的色氨酸含量,利用实验室保藏的16株乳酸杆菌筛选出一株具有较高降解色氨酸能力的菌株。将75只8周龄C57BL/6N雄鼠分为5组:正常组、模型组、色氨酸组、1.0386组、1.0386+色氨酸组,分别以PBS、色氨酸、1.0386菌悬液以及1.0386和色氨酸混合物连续灌胃3周,在实验结束前最后一周,让小鼠饮用2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)7 d进行诱导溃疡性结肠炎小鼠模型,同时继续进行灌胃。造模期间,记录小鼠DAI;实验结束后,处死小鼠,测定结肠长度、器官重量以及结肠组织病理变化。结果表明,与正常组相比,DSS可显著降低小鼠体重,升高DAI指数,使结肠缩短并引起结肠组织损伤,上调血清中促炎因子,下调抑炎因子(P<0.05)。而植物乳杆菌KLDS1.0386联合色氨酸可显著改善DSS引起的体重下降、结肠缩短,并降低疾病活动指数和脾脏指数(P<0.05);此外,植物乳杆菌KLDS1.0386与色氨酸混合干预显著下调促炎因子IL-6含量,上调抑炎因子IL-10的含量(P<0.05)。因此,植物乳杆菌KLDS1.0386联合色氨酸可以有效改善溃疡性结肠炎小鼠的结肠病理损伤。     

乳铁蛋白对环磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保护作用

探讨乳铁蛋白对环磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保护作用。Balb/c小鼠随机分为6组,正常对照组,模型对照组,乳铁蛋白组(5、25、50、500 mg/kg)。连续灌胃给药27 d,第27天给药后除正常对照组外,其他小鼠均腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg,继续灌胃至第30天,末次给药24 h后,放射免疫分析方法测定各组小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞。酶联免疫分析方法检测血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4,IL-10的变化。与正常对照组相比,模型小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率明显增加;血清IFN-γ明显降低(p<0.01),IL-4明显增高(p<0.05),IFN-γ/IL-4比值明显下降(p<0.01);乳铁蛋白25、50、500 mg小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞百分率明显降低(P<0.01或P<0.05)。乳铁蛋白500 mg组小鼠血清IFN-γ较模型组明显增高(p<0.05),乳铁蛋白50、500 mg小鼠血清IFN-γ/IL-4比值趋于正常。乳铁蛋白能不同程度修复环磷酰胺所致小鼠免疫失衡状态,具有免疫保护作用。     

瑞士乳杆菌对小鼠肠道黏膜和肠组织中细胞因子影响的研究

了解服用益生菌小鼠肠道黏膜和组织中细胞因子的变化情况,对阐明其对小鼠肠道黏膜免疫的影响具有重要的价值。本实验将60 只小鼠随机分成4 组：日食对照组、生理盐水对照组、瑞士乳杆菌灌喂组和大肠杆菌对照组,连续灌喂15d,采集小鼠小肠利用ELISA 法测得各组小鼠肠道黏膜和肠道组织中细胞因子的含量,并作分析。研究结果证实,与对照组相比,瑞士乳杆菌灌胃组小鼠肠黏膜和组织中4 种细胞因子明显升高,且存在显著性差异(P ＜ 0.05)：白介素-2IL-2 在3d 前达到最大值、白介素-4(IL-4)在5d 达到最高点、白介素-6(IL-6)在5d 达到顶峰、干扰素- γ(IFN- γ)在3d 前达到最大值;与对照组相比,瑞士乳杆菌灌胃组小鼠Th1 型和Th2 型T 细胞的不存在显著性差异(P ＞ 0.05),肠道免疫功能未出现异常,而大肠杆菌灌胃组Th1 型和Th2 型T 细胞平衡被打乱,免疫功能出现异常。     

植物乳杆菌调节抗体和细胞因子水平缓解食物过敏的机制

食物过敏危害人体健康,利用益生菌特有的抗过敏作用来缓解食物过敏是治疗食物过敏的新方向,然而目前关于益生菌缓解过敏的机制研究还不够深入。本文以前期筛选出的具有抗过敏功能的4株植物乳杆菌为研究对象,利用Balb/c小鼠建立食物过敏模型,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光定量PCR(RT-PCR)等方法研究植物乳杆菌对Th1/Th2相关细胞因子、抗体分泌的影响。ELISA结果表明,将4株植物乳杆菌与致敏小鼠脾细胞共培养可降低IL-4的分泌水平,增加IFN-γ的分泌水平,而荧光定量结果证实IL-4及其转录因子GATA-3 m RNA表达水平显著降低,IFN-γ及其转录因子T-bet mRNA表达水平显著升高,这一结果与细胞因子分泌水平结果一致。此外,4株植物乳杆菌均可下调致敏小鼠血清中IgE分泌水平,缓解由食物过敏造成的肠道黏膜及肺泡组织损伤。这些结果说明植物乳杆菌通过调节Th1/Th2平衡来缓解食物过敏。     

抑制致病菌益生乳杆菌的胁迫耐受性及免疫活性

以16株乳杆菌为研究对象,分析其对病原菌金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌的抑菌能力,黏附及干预病原菌黏附Caco-2细胞的作用,对酸及胆盐胁迫的抗逆性及对免疫细胞的调节活性。结果表明,植物乳杆菌KLDS 1.0328等乳杆菌的无细胞发酵上清液的抑菌圈直径均在15 mm以上。以鼠李糖乳杆菌LGG为对照,体外筛选出6株对Caco-2细胞体外黏附能力强或与之相当的菌株。基于竞争、排阻及置换试验,复筛出4株抑制病原菌和对Caco-2细胞黏附能力较强的乳杆菌,其中植物乳杆菌KLDS 1.0328竞争性抑制鼠伤寒沙门氏菌的抑制率为(72.52 ± 4.94)%。此外,证实植物乳杆菌KLDS 1.0328对酸及胆盐的耐受性较强,对免疫细胞活性有较好的调节作用,具有在食品工业开发、应用的潜力。     

乳源糖巨肽对小鼠IFN-γ和IL-4的调节作用

研究了乳源糖巨肽(GMP)对健康Balb、鼠IFN-γ和IL-4的调节作用,从细胞因子的角度探讨了GMP维系机体健康的机制.对健康小鼠用GMP灌胃后,分别检测一次灌胃GMP后12 h内小鼠IFN-γ,IL-4每2 h的表达量的变化和连续5 d灌胃GMP对小鼠IFN-γ、IL-4的表达量,及IFN-γ/IL-4浓度比值的变化.结果表明,一次灌胃GMP4短时间(12 h)内可促进小鼠IL-4的表达,以灌胃后第6h的增加最为显著,但对炎症细胞因子IFN-γ没有显著性影响;连续5 d灌胃GMP可促进小鼠IL-4的表达,其中第3天和第4天的变化呈显著性,对IFN-γ同样无显著性影响,因此第3天至第5天GMP组小鼠中IFN-γ/IL-4的比其他两组显著降低.本研究提示了GMP具有调节Th1/Th2失衡的功能.     

发酵乳杆菌HCS08-005对小鼠的免疫调节作用

为评价发酵乳杆菌HCS08-005的体内免疫调节作用,以环磷酰胺诱导小鼠构建免疫低下小鼠模型,分别用低、中、高剂量的活性发酵乳杆菌HCS08-005冻干菌粉进行免疫调节干预,测定血清中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)的含量和白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的相对表达量,利用碳廓清法检测小鼠吞噬细胞的吞噬能力及对脏器指数的影响,以角叉菜胶致炎小鼠建立足肿胀模型,通过计算足肿胀抑制率表达迟发型超敏反应。结果表明,HCS08-005可显著上调血清中IFA-γ、TNF-α、IL-4及IgG水平,下调IL-10水平,明显增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力和迟发型超敏反应,降低足肿胀抑制率。综上所述,发酵乳杆菌HCS08-005可以发挥一定的免疫调节作用。     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白对感染大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫功能的影响

研究嗜酸乳杆菌S-层蛋白对感染致病性大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫的影响。用5 M的氯化锂溶液对嗜酸乳杆菌的S-层蛋白进行提取,获得脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌菌体。将SPF级BALB/c小鼠随机分为对照组、致病性大肠杆菌感染组、嗜酸乳杆菌预防组治疗组,脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌预防组和治疗组六组,实验进行14 d。小鼠处死后取眼球血、小肠及肠黏膜,观察各组小鼠肠黏膜形态变化、肠黏膜功能因子表达的差异。致病性大肠杆菌感染组与对照组相比,肠黏膜形态明显改变,感染大肠杆菌的小鼠在灌胃嗜酸乳杆菌后各黏膜SIg A和IL-10含量明显升高,同时血清IFN-γ、TNF-α和IL-1β含量对比感染组有了显著下降,说明可以减缓炎症发生,并且比脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌治疗组对肠黏膜免疫保护效果好。嗜酸乳杆菌S-层蛋白对于嗜酸乳杆菌定植于肠黏膜并形成生物屏障保护其免疫功能有着重要影响。     

益生乳杆菌的筛选研究

以分离保存的15株乳杆菌为研究对象,从中筛选益生乳杆菌两株。通过检测乳杆菌的疏水性和自聚性,得到表面疏水性和自聚性均较高的菌株为Ind-3、CH10和M8。其中,乳杆菌CH10和M8在模拟胃肠环境下活菌数均达到106mL-1以上。通过灌胃乳杆菌CH10和M8,表明小鼠体重增加明显高与对照组,且实验组小鼠粪便中的β-半乳糖苷酶活性明显高于对照组。灌胃两株乳杆菌后,小鼠肠道内双歧杆菌与乳杆菌活菌数提高了,且肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌的生长繁殖受到不同程度的抑制,而对照组无明显变化。结果表明筛选出的两株乳杆菌可以促进小鼠对营养物质的吸收,提高肠道内有益菌的数量,抑制有害菌的生长繁殖,或许能够改善寄主肠道的微生态环境。     

使用FISH-FC测定益生菌对肠道菌群失衡的调节作用

目的：使用荧光原位杂交-流式细胞计数法(FISH-FC)测定灌胃自筛菌株嗜酸乳杆菌KLDS1.8701与植物乳杆菌KLDS1.0355混合液对抗生素性肠道菌群失衡小鼠的影响,并初步研究其发挥作用的机制。方法：在体外实验中,测定上述两株菌对肠道病原菌的抑制作用,并探讨其作用机理。在体内实验中,采用随机饮用盐酸克林霉素水溶液(2.8mg/mL)的方法建立抗生素性肠道菌群失衡小鼠模型,并使用FISH-FC方法测定小鼠粪便中总厌氧菌、球形梭菌属(Clostridium coccoides-Eubacterium rectale)、肠杆菌(Enterobacteria)、拟杆菌属(Bacteroides-Prevotella)的数量变化,以此判断模型是否建立成功。之后,灌胃嗜酸乳杆菌KLDS1.8701和植物乳杆菌KLDS1.0355的混合液(活菌数分别为107、108、109CFU/mL),以生理盐水为对照,采用上述方法评价混合菌液对小鼠模型的影响。结果：与对照组相比,灌胃混合菌液组可迅速恢复肠道菌群平衡(P＜0.01),产生作用的效应剂量为107CFU/mL。结论：直接的抗微生物效应可能是该混合菌液调节肠道菌群平衡的机制之一。     

弱后酸化保加利亚乳杆菌突变菌株的遗传稳定性研究

对从传统乳制品中筛选得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变株KLDS 1.9201-4的遗传稳定性进行研究。将突变菌株进行连续传代,观察形态学变化,利用HPLC分析葡萄糖和乳酸的代谢情况,RAPD分析基因组DNA的稳定性。结果表明,突变菌株KLDS1.9201-4能够稳定遗传至第8代,在传代过程中菌落和菌体特征没有发生明显变化,KLDS 1.9201-4对初始葡萄糖的代谢率逐渐升高,终产物中乳酸的浓度也逐渐升高。KLDS 1.9201-4的基因组DNA相对稳定,没有发生明显变异。弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种的自发突变株KLDS 1.9201-4具有适宜的遗传稳定性,可被用于制作弱后酸化的酸奶发酵剂。     

瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜免疫应答及细胞因子的影响

探讨灌胃瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus TS206)发酵制品对健康Balb/c 小鼠肠道黏膜免疫应答及细胞因子的影响。本实验将Balb/c 小鼠分为空白对照组、生理盐水组和瑞士乳杆菌组3 组,瑞士乳杆菌组的灌胃剂量为108CFU/mL,分别在灌胃后0 、1 、2、3 、4 、6 、8、12、24h 处死小鼠得到小肠组织样品,利用RIA 法和ELISA 法测得各组小鼠肠道黏膜SIgA 和细胞因子的含量,并作统计分析。结论：灌胃组小鼠肠道黏膜中SIgA 的含量与生理盐水对照组相比差异极显著(P ＜ 0.01);灌胃组小鼠肠道黏膜中IL-2 和IFN-γ的含量与生理盐水对照组相比具有显著性差异(P ＜ 0.05);灌胃组IL-4 与生理盐水对照组相比含量明显升高(P ＜ 0.05);而灌胃组和生理盐水对照组相比IL-6 的表达水平后期差异不显著(P ＞ 0.05);IFN-γ/IL-4 的值处于相互拮抗的状况,表明瑞士乳杆菌对健康小鼠具有维护肠黏膜免疫平衡的作用,也对保持Th1/Th2 平衡状态具有明显的作用,即证实瑞士乳杆菌作为益生菌具有调控小鼠肠道黏膜免疫应答的功效。     

嗜酸乳杆菌对β-乳球蛋白过敏诱发Thl/Th2细胞平衡的影响

目的:观察嗜酸乳杆菌对牛乳β-乳球蛋白(BLG)致敏小鼠Th1/Th2细胞平衡及血清抗体水平的影响,以研究其缓解过敏反应的作用。方法:用牛乳BLG和弗氏佐剂的混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验动物随机分为空白组、过敏组与不同剂量的嗜酸乳杆菌组。采用ELISA法测定各组小鼠血清总IgE、BLG特异性IgE和总IgG含量。体外分离培养各组小鼠脾淋巴细胞,采用ELISA法检测细胞上清液中Th1型细胞因子(IL-12、IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4)的水平。结果:中、高剂量嗜酸乳杆菌组小鼠的IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2细胞平衡)显著高于过敏组(P<0.05);而其血清中的总IgE、BLG特异性IgE和总IgG水平显著低于过敏组(P<0.05),与空白组相比无差异性(P>0.05)。结论:嗜酸乳杆菌干预可改善小鼠的BLG过敏症状,其作用可能与促进Th1占优势的Th1/Th2细胞平衡,阻断IgE及IgG分泌相关。     

植物乳杆菌1201对DSS诱导结肠炎的缓解作用

结肠炎是一种具有复发特性的炎症性肠病,近几十年来发病率不断上升。越来越多的研究表明益生菌可缓解结肠炎。本研究通过建立葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium, DSS)诱导的结肠炎小鼠模型,探究植物乳杆菌1201(Lactobacillus plantarum 1201)对DSS诱导结肠炎的缓解作用。将实验小鼠分为正常组、模型组、1201组,对除正常组外其余组小鼠诱导结肠炎,同时对1201组小鼠每日灌胃0.2 mL的1×10⁹ CFU/mL植物乳杆菌1201,持续12 d。通过H&E染色观察小鼠结肠形态,采用荧光定量PCR技术检测小鼠结肠组织NF-κB、炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-22、IFN-γ、IL-17A、TGF-β1)和结肠紧密连接蛋白(ZO-1、Ocludin和Claudin-3)的mRNA表达水平;此外,使用16S rRNA高测序技术检测小鼠肠道菌群的变化,采用代谢组学分析肠道代谢物的变化。结果表明,植物乳杆菌1201通过降低肠道Firmicutes/Bacteroidetes的比率,增加乳酸杆菌Bifidobact...     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌发酵乳的流变特性研究

以两株嗜酸乳杆菌(KLDS AD1、KLDS AD2)和3株双歧杆菌(长双歧杆菌KLDS 2.0001、婴儿双歧杆菌KLDS 2.0002和KLDS 2.0604)分别发酵的酸乳为研究对象,测定其pH值、滴定酸度、质构及流变学特性。pH值和滴定酸度测定结果表明嗜酸乳杆菌产酸能力强于双歧杆菌。质构测定结果表明嗜酸乳杆菌发酵的酸奶质地较为结实。5种酸乳的剪切力升速和降速曲线都能形成触变环,触变环的面积大小为KLDS 2.0604＞KLDS 2.0001＞KLDS AD2＞KLDS 2.0002＞KLDS AD1,即婴儿双歧杆菌KLDS 2.0604在剪切力破坏下其组织状态的恢复力最差,很难恢复到起始状态。表观黏度曲线在下降时只有婴儿双歧杆菌KLDS 2.0002没有出现突增现象,其弹性最差。综合得出嗜酸乳杆菌KLDS AD2发酵乳的组织状态、黏弹性最好。     

乳铁蛋白对卵清白蛋白过敏小鼠外周血中Th1/Th2细胞平衡的影响

利用卵清白蛋白(OVA)建立BALB/C小鼠食物过敏模型,观察乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)对该食物过敏机体的免疫调节作用。小鼠分别接受预防性乳铁蛋白处理和胃肠道刺激期间灌胃乳铁蛋白,最后一次处理1h后检测其外周血中IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-12p40和IgE的变化。结果表明:2mg/(kg.d)(以体质量计)的Lf在胃肠道刺激期间显著提高了IFN-γ和IL-12p40水平而降低了IL-4和IL-6水平,但20mg/(kg.d)的Lf降低了所有这些细胞因子。同时,Lf明显降低了血清中IgE浓度而提高了IFN-γ/IL-4比值,20mg/(kg.d)的Lf对IgE影响较大,2mg/kg的Lf对IFN-γ/IL-4比值影响较大。此外,预防性处理中的Lf均显著降低了IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TGF-β和IgE水平,并且20mg/(kg.d)的Lf效果较好,且该剂量明显提高了IFN-γ/IL-4比值。因此,Lf能够改善OVA诱导的食物过敏小鼠Th1/Th2细胞的平衡,具有重要的免疫调节作用。     

保加利亚乳杆菌水解酪蛋白能力及产物分析

为了深入研究保加利亚乳杆菌酪蛋白水解情况。本试验主要以保加利亚乳杆菌ATCC 11842作为研究对象,同时以保加利亚乳杆菌KLDS 08007、KLDS 08009、KLDS 08010、KLDS 08014和KLDS 08018作为对照研究,测定不同菌株发酵液的酪蛋白水解度和多肽含量,同时对ATCC 11842的酪蛋白水解产物进行SDS-PAGE电泳分析和LC-MS分析。结果表明:ATCC 11842的水解能力最强,水解度为13.89%,多肽含量为0.63 mg/m L。测定六株保加利亚乳杆菌细胞壁蛋白酶的活性与水解能力进行比较分析发现,该酶活性与菌株的水解能力呈正相关,ATCC 11842的酶活力最强,达到15.52 U/m L,比活力为6.73 U/mg。通过电泳图谱发现,随着发酵时间的延长,酪蛋白逐渐水解,并生成3.4~21.0 ku的多肽。对水解物进行LC-MS分析,酪蛋白水解后共产生77种6~25肽的片段,其中6~7肽占片段种类的9%,8~14肽占多肽种类的77%。     

发酵乳杆菌HCS08-005耐逆性及对体外细胞免疫调节作用的研究

目的 研究发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) HCS08-005耐逆性及对体外细胞的免疫调节作用。方法 考察发酵乳杆菌HCS08-005的耐酸耐胆盐能力，并应用发酵乳杆菌HCS08-005细胞裂解物，处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和小鼠脾脏细胞，用酶联免疫吸附测定试剂盒检测各类炎症因子包括肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-2 (inter-leukin-2，IL-2)、白细胞介素-12 (inter-leukin-12，IL-12)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)的表达水平。结果 显示发酵乳杆菌HCS08-005有较好的耐逆性，能够耐受酸和胆盐环境到达肠道发挥作用。不同浓度的发酵乳杆菌HCS08-005细胞裂解物对小鼠脾脏细胞和巨噬细胞分泌炎症因子均有极显著影响(P<0.01)，在质量浓度为100 μg/g时，IL-2分泌量为421.49 pg/g，TNF-α分泌量为161.23 pg/g，IFN-γ分泌量为846.14 pg/g，IL-12分泌量为12.88 pg/g，因子水平极显著提高(P<0.01)。结论 在体外细胞试验中，发酵乳杆菌HCS08-005有较好的耐逆性，对体外细胞有免疫调节作用。