表达豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)的转基因NC89的抗虫性研究

利用 Ti 质粒介导的叶圆盘转化法,将豇豆腋蛋白酶抑制剂基因导入 NC89,并获得再生植株,对转基因植株进行了室内和田间抗虫性鉴定,结果表明,21%的植株对烟青虫危害具有高度抗性;另45%的植株对烟青虫危害具有明显抗性。转基因烟草的叶面平均虫害面积只有对照 NC89的25%。     

烤烟新品种龙烟101的选育及特征特性

龙烟101是以优质、抗烟草普通花叶病毒病（tobaccomosaicvirus,TMV）、适应性强为育种目标,采用烤烟品种龙江925为母本,抗TMV品种CV91为父本,杂交后经系谱法选育而成的免疫TMV烤烟新品种。多年试验结果表明,龙烟101遗传性状稳定,植株结构及田间群体结构合理,田间生长势强、耐连作;免疫TMV,中抗黑胫病,靶斑病较轻,感青枯病、CMV和PVY,综合抗性与对照NC89相当;主要经济性状和原烟外观质量优于对照NC89,化学成分较适宜,感官质量与对照NC89相当。综合评价,龙烟101在品质、产量和抗病、抗逆性等方面均较好,适宜东北烟区和黄淮部分烟区种植。     

转基因NC89品种对花叶病的抗病性研究及主要性状分析

1991年～1992年对利用基因工程技术培育的转基因NC89品种进行了抗病性研究.在人工接种条件下转基因NC89品种的发病率、病情指数显著低于对照,相对防效1991年和1992年分别为73.4%和76.3%.表现出较强的抗病性.在自然发病条件下(花叶病流行年),其发病率和病情指数大大低于普通NC89,表现明显的抗病性.烟叶化学成分和评吸结果与普通NC89基本一致.     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

烤烟新品种龙江912的选育及其特征特性

烤烟新品种龙江912是以龙江851为母本,Coker 176为父本杂交,系谱法定向选择培育而成,2007年通过全国烟草品种审定委员会审定。该品种中抗黑胫病,抗赤星病,免疫TMV,中感青枯病,高感CMV和PVY;其主要经济性状比对照NC89有不同程度的提高;外观品质与对照品种NC89相当;烟叶各成分含量适宜,内在化学成分协调,烟叶吸食品质略优于对照NC89。龙江912出丝率与填充性高于对照NC89,是体现鲜明龙江特色烟叶的品种。     

抗PVYN烟草突变株SN01的筛选及其生理生化特性

为筛选出烟草抗PVYN种质资源,利用病毒汁液摩擦接种法,从烤烟品种NC89烟株中筛选出一株自然突变的抗PVYN变异株,留取其种子编号为SN01.接种PVYN后,对抗病植株SN01与常规NC89烟株的总酚、类黄酮、丙二醛含量以及多酚氧化酶(PPO)活性进行了比较.结果表明:在接种后第12 d烟草抗PVYN突变株SN01的总酚和类黄酮含量最高,高于常规NC89,丙二醛含量基本无变化,PPO活性在接种后第15 d有小幅度升高,但明显低于接种后常规NC89的PPO活性,说明在接种PVYN后抗病突变株与常规NC89烟株的生理指标有明显差异,抗病突变株对病毒的侵染有较强的抵抗和调节能力.     

利用双层培养基筛选烟草抗赤星病突变体

在接种有赤星病菌(Alternaria alternata)的双层培养基上,成功地从高感赤星病烟草品种 NC89的花药中诱导出突变体苗,对这些突变体苗进行了离体抗病性鉴定,结果表明:其中70％的植株不同程度地表现赤星病抗性,部分表现高度抗性。     

不同烤烟品种烟叶衰老特性与内源激素的关系

为明确不同烤烟品种烟叶衰老特性与内源激素变化的关系,以田间成熟落黄表现不同的4个烤烟品种(豫烟10号、云烟87、K326和NC89)中部叶为材料,分析了不同品种叶片发育成熟过程中叶绿素含量(质量分数)、衰老标志基因、内源激素含量及相关基因表达量的变化。结果表明:在豫中烟区常规大田栽培条件下,随着烟株叶龄的增加叶绿素含量逐渐降低,烟叶衰老程度加剧,脱落酸(ABA)含量升高,赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和细胞分裂素(CTK)含量降低。豫烟10号品种中部叶衰老速度较快,云烟87和K326居中,NC89衰老速度较慢。与NC89品种相比,豫烟10号品种中部叶随着叶龄的增加,ABA含量保持在较高水平,而延缓衰老的GA3、CTK和IAA含量指标均较低,衰老上调标志基因CP1和CP23的表达量较高,衰老下调表达基因PSA1和MC的表达量较低,分别调控乙烯、ABA和茉莉酸的相关基因NtEFE26、NtNCED1和NtPR1b表达量均较高,水杨酸应答基因NtCHN50的表达量较低。烤烟品种烟叶衰老特性差异与自身的激素代谢密切相关,成熟落黄快的品种表现出ABA、乙烯和茉莉酸代谢旺盛的特点。     

过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因Sik CDPK1在-4℃低温胁迫处理下的表达量,发现低温胁迫可以诱导天山雪莲内源Sik CDPK1基因表达,且在处理3 h表达量迅速积累达到最高值。将Sik CDPK1基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pCAMBIA2300上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,发现转基因烟草植株在低温胁迫后,耐低温能力明显增强;脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均高于非转基因烟草植株;丙二醛含量和相对电导率均低于非转基因烟草植株。上述研究结果表明,SikCDPK1基因可以通过积累渗透调节物质、增强抗氧化酶活性和维持细胞膜稳定性来提高植物的耐低温能力。     

烟草对赤星病菌的抗性与其防御酶系活性的关系

室内对抗病性不同的烟草品种CV 87和NC 89接种赤星病菌 ,分析测定接种后不同时间、不同叶位过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT)以及苯丙氨酸解氨酶 (PAL)等同工酶酶活性变化情况。结果表明 ,抗病品种CV 87随接种叶位升高POD与CAT活性增加 ,感病品种NC 89表现先升高后降低的趋势。无论接种与否NC 89的POD活性都高于CV 87;抗病品种CV 87的CAT活性高于感病品种 ;接种赤星病菌后,抗病品种CV 87的PAL活性升高 ,感病品种NC 89的PAL活性降低 ,PAL活性与品种抗病性呈正相关     

利用细胞工程筛选烟草抗赤星病突变体的研究——一种双层培养基筛选系统的建立

为有效筛选烟草抗赤星病细胞突变体,本研究建立了一种双层培养基筛选系统。即在下层培养基中接种烟草赤星病(Alternaria alternata),在上层培养基中接种烤烟品种 NC89和净叶黄的花药(NC89高感赤星病,净叶黄高抗赤星病)。在26±1℃培养40天后发现,NC89的花药出苗率和花药平均出苗数与对照(不接种赤星病的培养基)相比,分别由30%和53颗降到2%和12颗,而净叶黄的花药出苗率和平均出苗数基本没有变化。对筛选出来的 NC89花培突变体进行了田间赤星病抗性鉴定,其中80%对赤星病抗性较 NC89有所提高,甚至部分接近高抗。这说明该双层培养基系统可以有效地对抗烟草赤星病的细胞突变体进行筛选。本系统尤其适应于(1)需长期培养;(2)毒素不易制备或易失活的病原菌的抗性筛选。     

平顶山烟区主要种植烤烟品种光合生理特性研究

为了弄清平顶山烟区主要烤烟品种旺长期的光合差异,以烤烟品种NC297、NC89和中烟100为供试材料,利用LI-6400便携式光合测定系统对各品种的光响应曲线进行了拟合,对其旺长期光合生理指标及光合色素含量的差异进行了研究.结果表明,随着光照强度的增大,气孔导度、净光合速率和蒸腾速率随之升高,而胞间CO₂浓度则随之降低;NC297和NC89在强光下出现光抑制现象,中烟100在设定的光强内光合速率未达到完全饱和;中烟100的光补偿点(LCP)最低,光饱和点(LSP)最高,呼吸速率最低,NC297的最大净光合速率最高,NC89的表观量子效率(AQY)最高;叶绿素、类胡萝卜素含量均以NC89最高,中烟100最低,中烟100的叶绿素a/b最高.     

过氧化物酶活性与烟草对马铃薯Y病毒抗性关系的研究

本文测定了接种马铃薯Y病毒脉坏死株系后烟草抗病转基因品系9608(转PVY-NIb的NC89)和非转基因NC89叶片组织透性和过氧化物酶活性,并对过氧化物酶同工酶带谱进行了分析。结果表明,抗病转基因9608和感病NC89叶片的组织透性与叶片内过氧化物酶活性的变化趋势一致,两者在接种后均呈增高趋势,但感病NC89的增高幅度明显高于抗病转基因9608;接种后,转基因9608和非转基因NC89的过氧化物同工酶均出现了一条新酶带,9608的新酶带在接种后第2d开始出现,而NC89的新酶带则在接种后第6d开始出现,且明显强于9608。      

干旱对不同烤烟品种的生理及其烟株生长势的影响

在盆栽条件下,研究了不同烤烟品种(NC89,K346,K358)经干旱处理后烟株的生长、发育及对水分适应能力的强弱.试验结果表明,干旱处理后K346品种抗旱性的几种生理生化指标高于NC89和K358,表现为K346对干旱胁迫的调节能力较强,优于其它两个品种;根冠比K358＞K346＞NC89;K358在干旱胁迫后再复水,其生长势要强于NC89和K346.     

烟草过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达特征分析

基于GeneBank中已有的植物Catalase 1（CAT1）基因序列设计烟草CAT1的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT1全长mRNA序列,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示NC89 CAT1中与N .benthamiana CAT1基因亲缘关系最近。利用real-time RT-PCR技术对CAT1基因在烟草中的组织表达特异性和烟草NC89应对生物和非生物胁迫的表达差异进行了分析。结果表明CAT1基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在根部表达量最低,在叶中相对表达量最高。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT1诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱、和感染TMV CAT1表达量上调,紫外胁迫下表达量下调。上述研究表明烟草CAT1基因可能参与了植物的生长发育、应对非生物和生物胁迫的过程。      

兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒弱毒疫苗的创制

黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯X病毒（PVX）在烟草中普遍存在、危害严重，对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒，需要构建能够同时预防CMV和PVX的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMVFny-R2-2bPT，在此突变体中插入200 bp的PVX保守序列（5890-6089）获得突变体质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMVFny RNA1和CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草，接种后烟草症状与野生型CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVX 200 bp保守片段稳定存在，CMV和PVX强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVX同时具备交叉保护作用。     

烟草过氧化氢酶基因CAT2克隆与表达特征分析

基于已有的植物Catalase 2基因（CAT2）序列设计烟草Nicotiana tabacum CAT2的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var.NC89 CAT2全长mRNA序列,包含1479 bp完整的读码框（ORF）,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示,烟草NC89 CAT2与N.benthamiana CAT2基因亲缘关系最近。利用Quantitative Real-time PCR技术分析了CAT2基因在NC89烟草中的组织特异性表达和其应对生物和非生物胁迫的表达差异。结果表明,CAT2基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在花中相对表达量最高,其次为叶、茎、种子和根。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT2诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱和感染PVY时CAT2表达量均上调。上述研究表明烟草CAT2基因可能参与了应对非生物和生物胁迫的过程。     

烤烟新品种许金101的选育及特征特性

为了选育抗根部病害的烤烟新品种,以南江3号为母本、双抗70为父本,得到纯系品种许金101。多年试验结果表明,该品种遗传性状稳定,主要经济性状优于对照NC89和中烟100。抗镰刀菌根腐病,中抗黑胫病和根结线虫病,中感青枯病、CMV和PVY,综合抗病能力与NC89相当;烘烤特性好,烤后原烟外观质量较好,化学成分较协调,能够满足工业企业的需要。该品种根部病害抗性较好,特别是对镰刀菌根腐病的抗性提高,适宜在我国黄淮烟区特别是平原区种植。     

不同抗性烟草种质对CMV侵染的细胞响应差异分析

为解析烟草对CMV的抗病细胞学机制,以抗病品种台烟8号和感病品种NC82为材料,利用透射电子显微镜对比两品种在接种CMV后发病过程中的细胞超微结构变化。结果表明：（1）接种CMV后,台烟8号发病症状多为花叶,NC82发病症状多泡斑和深绿、褪绿区域相间;（2）对比NC82轻微花叶和泡斑的超微结构发现,二者叶绿体类囊体片层都减少,但泡斑症状细胞内线粒体嵴和CMV颗粒密度都高于轻微花叶症状细胞,说明泡斑的细胞病变程度重于花叶症状;对比NC82和台烟8号的深绿和褪绿区域细胞超微结构发现,深绿区域的叶绿体形态较完整,而褪绿区域的叶绿体严重变形、类囊体片层紊乱、淀粉粒畸形或消失,说明褪绿区域叶肉细胞病变程度重于深绿区域;（3）对比所有病变叶片中过氧化物酶、自噬小体及内膜系统结构发现,台烟8号在CMV侵染后,其三者形态结构都比NC82的更规则有序。研究结果为进一步探究抗CMV烟草品种的抗性分子机制提供理论依据。     

烟草体细胞杂交优质抗病株系的选育

为了选育抗花叶病的烟草新品种 ,用G 140与抗花叶病的野生波叶烟草 (N .undulata)进行了体细胞杂交 (即两种烟草的体细胞原生质体融合 ) ,其后代经过形态学鉴定 ,过氧化物酶同功酶酶谱鉴定、细胞学染色体数目检测 ,确定为体细胞杂种植株。采用定向筛选和回交手段选育体细胞杂种植株 ,经过 3年的田间筛选鉴定 ,得到了体细胞杂交单株自交系 ,从中再经筛选和攻毒试验获得了几个综合农艺性状好 ,抗或耐花叶病的优良单株和株系