纤细裸藻△9-脂肪酸延长酶基因在解脂耶氏酵母中的表达

从纤细裸藻c DNA中克隆出△9-脂肪酸延长酶基因,与解脂耶氏酵母整合载体p INA1297连接构建重组质粒p INA1297-△9E,用电击转化法将重组质粒转化到解脂耶氏酵母中,筛选得到阳性表达菌株YL△9E。在酵母浸出粉胨葡萄糖培养(YPD)条件下,工程酵母YL△9E的菌体生长速率高于对照菌株polf。对工程酵母YL△9E进行脂肪酸成分分析,结果表明△9-脂肪酸延长酶基因获得表达,产生了二十碳二烯酸(EDA),其含量可高达14.8%。     

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究

对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的酶反应体系进行了研究。实验发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉(105U/mg)在50mmol/L p H7.0 Tris-HCl(含7.5mmol/L黄胆酸钠),100mmol/L p H6.0磷酸钠缓冲液(含1000U脂肪酶)的体系中,水解产生阿魏酸的得率为2.94%。为了进一步提高脂肪酶水解效率,对解脂耶氏酵母脂肪酶中主要组分lip2脂肪酶基因进行了克隆,整合至毕赤酵母GS115基因组后发酵制取lip2脂肪酶粉(70.1U/mg),于上述酶解体系中进行水解谷维素实验。实验结果表明阿魏酸产率为2.87%。获得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率,但是获得了单一的脂肪酶基因,为进一步采取分子进化技术提高其催化能力奠定了基础。     

外源底物亚油酸对解脂耶氏酵母重组菌株合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株的反-10,顺-12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)产量,采用YNBDL培养基进行摇瓶发酵,考察了在培养基中添加不同纯度的亚油酸对解脂耶氏酵母合成t10,c12-CLA的影响。结果表明:亚油酸纯度的提高对菌株的生长和产脂未产生影响,且t10,c12-CLA的产量随亚油酸纯度的增加而提高,最高产量可达3.7 g/L;用大豆油替代培养基中的亚油酸,t10,c12-CLA的转化率从20%提高至25%,菌株生长、产脂及t10,c12-CLA产量与添加纯度为65%亚油酸的结果相近。实验证明解脂耶氏酵母重组菌株能够高效转化富含亚油酸的植物油合成t10,c12-CLA。     

亚油酸水合酶生物合成微生物源羟基不饱和脂肪酸的研究进展

羟基不饱和脂肪酸（Hydroxy unsaturated fatty acids, HUFA）是一类功能性脂肪酸,其生物合成法特异性强、对环境友好,是HUFA制备的主要方法之一。本文就两种较受关注的微生物源HUFA,即10-羟基-12-十八碳烯酸（10-hydroxy-12-octadecenoic acid,10-HOE）、13-羟基-9-十八碳烯酸（13-hydroxy-9-octadecenoic acid,13-HOE）进行了来源、功能特性及应用的介绍,归纳总结了用于合成10-HOE和13-HOE的亚油酸水合酶的研究进展;最后展望了HUFA功能特性和生物合成的研究方向,建议基于胶体界面化学理论来提高亚油酸水合酶合成HUFA的转化效率。     

植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定

以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 k Da,理论等电点为5. 15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白。Ser、Thr、Tyr磷酸化位点个数分别为3、3、7。蛋白质的二级结构主要构成方式为α螺旋、无规则卷曲和β折叠。将此基因连接到p ET-28a(+)质粒载体中构建重组质粒p ET28a-DH,并转化入大肠杆菌E. coli Transetta (DE3)中获得重组大肠杆菌。重组菌在16℃条件下,经0. 1 mmol/L IPTG诱导16 h有可溶性表达,经Western Blot验证确定为重组羟基脂肪酸脱氢酶。通过镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶。重组酶经初步活性检测,结果显示重组酶可以转化10-羟基-顺-12-十八碳烯酸为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,本研究为进一步探明植物乳杆菌P-8转化共轭亚油酸的机制奠定了基础。     

含油酸培养基培养对重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸的影响

亚油酸异构酶(PAI)在解脂耶氏酵母细胞内成功表达,以添加外源c9,c12-亚油酸(c9,c12-LA)为底物,全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸(trans10,cis12-conjugated linoleic acid,t10,c12-CLA)。解脂耶氏酵母在分别含0.0(对照组)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的培养基中生长,收集菌体转移至磷酸盐缓液中进行全细胞催化,比较各组菌体的t10,c12-CLA产率,含5.0 g/L油酸组产物产率最高,达到1.34 g/g,是不含油酸组的1.4倍左右。通过PAI酶活分析及Western blot检测PAI表达量,结果表明,培养基中油酸含量越高,重组解脂耶氏酵母的PAI表达量越低;对比不含油酸组和含5.0 g/L油酸组全细胞催化不同时间的t10,c12-CLA产量,含5.0 g/L油酸组t10,c12-CLA产量最高点的时间比不含油酸组提前约20 h;透射电子显微镜观察2组的菌体状态,含5.0 g/L油酸组细胞壁和细胞膜间隙扩大,该变化可能增加了全细胞催化过程中底物和产物进出细胞的速率,从而提高t10,c12-CLA的转化效率。     

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的菌株，对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原（myosin-cross-reactive antigen，MCRA）基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆，克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带，说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因，构建重组菌突变体库，利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌243 株，吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4，提高了5.02 倍；pCold-yclai-p-gfp重组菌156 株，产量最高的为39号菌（11.62±0.003 6）μg/mL，提高了2.99 倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因，并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。     

10-羟基-12-十八碳烯酸的静息细胞合成

10-羟基-12-十八碳烯酸(10-HOE)是一种典型的微生物源羟基不饱和脂肪酸,具有抑菌、抗炎、抗过敏等功效,在食品、药品、化工等行业具有很好的应用前景,因此,10-HOE的生物合成十分重要。本文以亚油酸为底物,以含10-亚油酸水合酶的重组大肠杆菌为催化剂,采用静息细胞法生物合成10-HOE,通过优化黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)浓度、溶剂种类及含量、甘油含量、氯化钠浓度、转化温度、溶液pH值、菌浓度、底物浓度和培养时间等9个单因素转化实验,来提高10-HOE的转化率。细胞转化生物合成的优化条件为:FAD浓度0.25 mmol/L,添加2%的正己烷,氯化钠浓度15 mmol/L,亚油酸底物质量浓度20 g/L,菌质量浓度200 g/L、溶液pH7.0,在37℃、200 r/min的摇床中培养24 h,获得的10-HOE转化率为(73.1±0.9)%,转化质量浓度为(16.3±0.2) g/L。该转化是目前为止10-HOE生物合成报道的最高转化浓度。本研究为大规模制备10-HOE提供了工艺路线,为工业化生产10-HOE提供参考。     

添加餐厨废油脂培养酵母进行γ-癸内酯生物转化

为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12. 5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h后获得与完全培养基相当的生物量。在Y. lipolytica中过表达酰基辅酶A氧化酶基因pox2获得工程菌,将蓖麻油酸转化为GDL产量达1. 5 g/L,是出发菌株的2. 2倍。利用分解油脂活性高的Y. lipolytica菌株(解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)与工程菌混菌降解餐厨废弃油脂并转化蓖麻油生产GDL,最佳条件为:当C. lipolytica与Y. lipolytica工程菌的接种比例为1∶10(体积比)、接种方式为先接种C. lipolytica,28℃,振荡培养(200 r/min) 12 h后再接种Y. lipolytica,混菌发酵培养基中GDL产量达0. 15 g/L,显著高于工程菌单菌发酵产量0. 08 g/L。结果表明,餐厨废弃油脂是廉价的碳源,通过不同菌株的混菌发酵转化生产GDL的方法具有很大的工业化应用前景。     

解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种重要的工业微生物菌种，被公认为食品级安全微生物。近年来，随着合成生物学和基因编辑技术的快速发展，科学家们利用合成生物学及基因编辑技术已经成功构建出了能够生产生物化学品、生物燃料、香料、药物、工业酶和药用蛋白等多种高附加值工业产品的解脂耶氏酵母细胞工厂，使得该酵母在食品、药品和生化能源等领域均具有巨大的应用潜力。本文将重点介绍解脂耶氏酵母表达系统、合成生物学元件和基因编辑方法的最新研究进展和应用情况，并对近年来以解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂生产高附加值产品的应用实例进行总结，希望为研究人员进一步利用解脂耶氏酵母进行底盘细胞设计、构建和优化相关合成途径并最终实现目的产物的高效合成提供有用的信息。     

微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展

相比于共轭亚油酸（CLA）的化学合成,微生物合成CLA与化学法具有培养灵活、对设备要求低、产物分离简单等优势。主要讨论了微生物合成CLA的研究进展,亚油酸（LA）能被微生物转化的原因,以及微生物合成CLA的机理。CLA的合成机理从微生物在动物瘤胃内混合发酵代谢LA和单一微生物在体外合成CLA两方面进行阐述。     

Effectiveness of oils rich in linoleic and linolenic acids to enhance conjugated linoleic acid in milk from dairy cows

Forty Holstein dairy cows were used to determine the effectiveness of linoleic or linolenic-rich oils to enhance C_18:2cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid (CLA) and C_18:1trans-11 (vaccenic acid; VA) in milk. The experimental design was a complete randomized design for 9 wk with measurements made during the last 6 wk. Cows were fed a basal diet containing 59% forage (control) or a basal diet supplemented with either 4% soybean oil (SO), 4% flaxseed oil (FO), or 2% soybean oil plus 2% flaxseed oil (SFO) on a dry matter basis. Total fatty acids in the diet were 3.27, 7.47, 7.61, and 7.50 g/100 g in control, SO, FO, and SFO diets, respectively. Feed intake, energy-corrected milk (ECM) yield, and ECM produced/kg of feed intake were similar among treatments. The proportions of VA were increased by 318, 105, and 206% in milk fat from cows in the SO, FO, and SFO groups compared with cows in the control group. Similar increases in C_18:2cis-9, trans-11 CLA were 273, 150, and 183% in SO, FO, and SFO treatments, respectively. Under similar feeding conditions, oils rich in linoleic acid (soybean oil) were more effective in enhancing VA and C_18:2cis-9, trans-11 CLA in milk fat than oils containing linolenic acid (flaxseed oil) in dairy cows fed high-forage diets (59% forage). The effects of mixing linoleic and linolenic acids (50:50) on enhancing VA and C_18:2cis-9, trans-11 CLA were additive, but not greater than when fed separately. Increasing the proportion of healthy fatty acids (VA and CLA) by feeding soybean or flaxseed oil would result in milk with higher nutritive and therapeutic value.     

产亚油酸异构酶的乳酸菌的筛选

对16株乳酸菌产亚油酸异构酶(linoleate isomerase)的能力进行分析,紫外分光光度法和气相色谱法分析发酵液中的共轭亚油酸(CLA),筛选出产亚油酸异构酶的乳酸菌,PCR扩增筛选出菌株的亚油酸异构酶基因,并对其进行序列分析.结果显示,通过紫外分光光度法检测16株乳酸菌中有9株菌可将亚油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA);气相检测6株乳酸菌的发酵液中存在cis-9,trans-11 CLA和trans-10,cis-12 CLA两种同分异构体(各占CLA总产量的50％);成功扩增出鼠李糖乳杆菌与亚油酸异构酶密切相关的肌球蛋白交叉反应抗原(MCRA)基因片段.     

植物乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及其性质研究

经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤,由植物乳杆菌(LactobacillusplantarumL 2 9)分离纯化得到亚油酸异构酶,分子量为4 3ku。对其酶学性质进行研究,结果表明,温度37℃、pH 6 0时酶活性较高;Co2 + 、Fe2 + 可提高酶的活性,Cu2 + 、Zn2 + 则对酶活力有抑制作用;该酶作用于亚油酸的Km=2 5 3×10 -5mol/L ,Vmax=2 5 7×10 -8mol/ (min·mg)。     

一株植物乳杆菌转化生成共轭亚油酸的特性研究

报道了一株植物乳杆菌(L.plantarumLT2-6)发酵转化亚油酸(LA)生成共轭亚油酸(CLA)的特性研究。微氧环境有利于CLA的生成;温度为37℃、初始pH为7.0、底物LA浓度为0.075%时,菌体生长及CLA生成量较高。时间曲线结果表明,接种后8h,CLA开始生成;发酵24h时,CLA生成量达到最高(0.29g/L),LA转化率为387%。生成的CLA产物主要为cis9,trans11/trans9,cis11-CLA。     

精氨酸-共轭亚油酸抗氧化活性研究

测定了精氨酸-共轭亚油酸清除超氧阴离子自由基(O2-.)、羟自由基(.OH)和二苯代苦味肼基自由基(DPPH.)的能力,并与VC的抗氧化活性进行了比较。结果表明:精氨酸-共轭亚油酸对3种自由基的清除能力均与其浓度存在着量效关系;精氨酸-共轭亚油酸对O2-.有一定的清除作用,但清除能力低于VC;精氨酸-共轭亚油酸对.OH和DPPH.有较强的清除作用,且清除能力均高于VC。在精氨酸和共轭亚油酸的协同作用下,精氨酸-共轭亚油酸的抗氧化活性得到增强。因此,精氨酸-共轭亚油酸是一种有效的抗氧化剂。     

Oxidation and textural characteristics of butter and ice cream with modified fatty acid profiles

The primary objective of this study was to evaluate oxidation and firmness of butter and ice cream made with modified milkfat containing enhanced amounts of linoleic acid or oleic acid. The influence of the fatty acid profile of the HO milkfat relating to product properties as compared with the influence the fatty acid profile of the HL milkfat was the main focus of the research. Altering the degree of unsaturation in milkfat may affect melting characteristics and oxidation rates, leading to quality issues in dairy products. Three milkfat compositions (high-oleic, high-linoleic, and control) were obtained by modifying the diets of Holstein cows. Ice cream and butter were processed from milkfat obtained from cows in each dietary group. Butter and ice cream samples were analyzed to determine fatty acid profile and firmness. High-oleic milkfat resulted in a softer butter. Solid fat index of high-oleic and high-linoleic milkfat was lower than the control. Control ice cream mix had higher viscosity compared with high-oleic and high-linoleic, but firmness of all ice creams was similar when measured between -17 and -13 degrees C. Nutritional and textural properties of butter and ice cream can be improved by modifying the diets of cows.     

植物乳杆菌ZS2058转化亚油酸为共轭亚油酸条件的初步研究

研究了植物乳杆菌ZS2058转化亚油酸为共轭亚油酸的条件,在培养基中添加10g/L吐温-80制成LA-吐温-80胶束溶液,可以提高CLA的转化率,最佳转化温度为35℃,添加1mg/mL的LA有较高的转化率和CLA产量。在MRS、SKM、KPB三种转化体系中SKM的转化率较高。在含LA的培养基中预培养12h,可以提高CLA的转化率。最佳转化接种量在1%～2%之间。     

亚油酸异构酶研究进展

亚油酸异构酶可催化亚油酸异构化为共轭亚油酸.随着共轭亚油酸的应用日益广泛,人们对亚油酸异构酶的研究也日益深入.在查阅大量文献的基础上,对亚油酸异构酶国内外的研究情况进行了综述.     

植物乳杆菌ZS2058生物转化产物共轭亚油酸的分析方法的研究

研究了紫外分光光度法、GC、Ag~+-HPLC和GC-MS四种分析方法对植物乳杆菌ZS2058生物转化亚油酸(LA)产生的共轭亚油酸(CLA)检测时的异同点。结果表明,这4种分析方法在对CLA进行检测时各有特色,应用范围也有不同。紫外分光光度法检测成本最低,操作最快速,但检测结果为转化产物中各种CLA异构体的总和,而GC、Ag~+-HPLC和GC-MS能将产物中的各类CLA异构体分开,可对复杂的生物转化产物进行分析。其中,GC的最大优点在于可以检测到转化底物LA,Ag~+-HPLC可将转化产物中c9,t11-CLA和t8,c10- CLA很好的分离,而GC-MS可以将各种异构体与其它副产物明确区分开来。总之,在检测生物转化法产生的CLA时,根据不同的实验需求来选择不同的检测方法,并需将这几种方法灵活的结合起来应用。