重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的 摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3).方法 利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3.结果 重组酶的表达量占菌体...     

重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化

目的获取活性高的重组SOD1／3杂合酶。方法用含pET—SOD1／3的工程菌诱导表达重组SOD1,3杂合酶,通过分析SDS—PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu^2＋、Zn^2＋浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明,用lmmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在A600=1．2时诱导,Cu^2＋、Zn^2＋浓度分别为2．4mmol／L,诱导温度15℃,诱导时间12h,能获得高活性重组SOD1／3,其比活性为1681U／mg。结论培养温度和Cu^2＋、Zn^2＋浓度是优化表达的最主要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加CU^2＋、Zn^2＋能促进重组酶活性提高。     

重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化

目的获取活性高的重组SOD 1/3杂合酶。方法用含pET-SOD 1/3的工程菌诱导表达重组SOD 1/3杂合酶,通过分析SDS-PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu 2+、Zn 2+浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在A600=1.2时诱导,Cu2+、Zn2+浓度分别为2.4 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间12 h,能获得高活性重组SOD 1/3,其比活性为1681U/mg。结论培养温度和Cu2+、Zn2+浓度是优化表达的最主要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加Cu2+、Zn2+能促进重组酶活性提高。     

金属螯合亲和层析法纯化玉米SOD及其酶学性质的研究

利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用金属螯合亲和层析纯化了SOD。电泳后活性染色与蛋白染色均得到3个条带,比活为8597,纯化倍数为307,回收率为29.4％,达到了电泳纯。结果表明玉米SOD亚基的分子量为16 000,最大紫外吸收在260nm处,该酶在pH值7～9、80％以下稳定,玉米SOD对KCN和H2O2敏感,对邻苯三酚的Vmax为49.50mmol／min、Km为0,163 4mmol／L。     

玉米SOD的纯化与化学修饰

本文利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用金属螯合亲和层析纯化了SOD。比活为8597,纯化倍数为307,回收率为29.4%,电泳后活性染色与蛋白染色均得到3个条带,达到了电泳纯。针对SOD稳定性较差的缺陷,进行了PEG修饰SOD研究。修饰率46%,SOD活性保持度为81%。修饰后的玉米SOD的温度稳定性、pH稳定性均明显提高,与天然SOD相比,PEG-SOD的胰蛋白酶酶切耐受性明显增强。结果表明,PEG修饰玉米SOD是可行的,PEG是一种较好的SOD化学修饰剂。     

毕赤酵母表达重组人源Cu/ZnSOD的分离纯化与稳定性表征

通过乙醇沉降、强阳离子交换、强阴离子交换等纯化方法对毕赤酵母表达的重组人源Cu/Zn SOD进行分离,并测定该纯化蛋白的热稳定性和pH稳定性.试验结果表明通过这些方法获得比活为12 881 U/mg的目标蛋白,该蛋白达到反相色谱纯.纯化后的SOD蛋白无论在低于75℃或在pH 3～10条件下放置2h,均能保持85％以上的活力.采用毕赤酵母体系生产SOD,产量大,纯化成本低,蛋白稳定性高,有利于重组人源Cu/Zn SOD的大规模生产及应用.     

黑脉羊肚菌SOD的纯化及特性研究

采用热击法和硫酸铵分级沉淀法对所提取的黑脉羊肚菌SOD进行纯化,对纯化后酶的热稳定性、p H稳定性、敏感性及同工酶类型等进行研究。结果表明:热击法最佳热击温度为60℃,最佳热击时间为15 min;硫酸铵分级沉淀法最佳盐溶条件是采用40%饱和度硫酸铵,最佳盐析条件是采用85%饱和度硫酸铵;所纯化的SOD表现出良好的热稳定性和p H稳定性,在60℃下保存60 min,其酶活保留超过50%,p H适应范围为6⁹;Mn2+对羊肚菌SOD有明显的激活作用,Fe2+对其有明显的抑制作用;该SOD能耐受过氧化氢,但对氯仿-乙醇和SDS较为敏感,黑脉羊肚菌SOD属于Mn-SOD类型。      

杂合抗菌肽Py-Sα真核表达载体的构建

本文根据抗菌肽Polyphemusin I和Spinigerinα的氨基酸序列,结合Pichia pastoris;偏爱密码子,人工设计合成杂合抗菌肽Py-Sα基因。按照正确的阅读框架将其定向克隆至真核表达载体p PICZαA上。经PCR及双酶切鉴定,所转化的宿主细胞中含有插入Py-Sα的重组质粒p PICZαA-Py-Sα,结果成功构建了杂合抗菌肽Py-Sα的真核表达载体。     

甘薯叶中SOD的分离纯化研究

通过比较几种提取的方法对纯化的倍数和酶活收率的影响,得到了甘薯叶上清液的较优提取纯化方法,即采用热变性,有机物丙酮沉淀及凝胶过滤纯化相结合的方法。热变性最佳时间为15min、温度为60℃,加入丙酮的量为其粗酶液的1.4倍。经凝胶过滤纯化,最终SOD酶活收率为61.5%,蛋白质去除率为97.9%,比活力达到1126.87U/mg,纯化倍数为30.32。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

为实现人源磷脂酶A₂的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA₂（PLA2G10）,并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白（MBP）为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA₂,转化E.coli BL21（DE3）后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,K_m值为12.2 mmol/L,V_max为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A₂的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。     

重组人汗腺抗菌素蛋白的异源可溶表达、发酵优化及分离纯化研究

目的:实现人汗腺抗菌素(Dermcidins,DCD-1L)的原核异源可溶表达,并进行纯化及活性分析.方法:首先检索NCBI确定人DCD-1L的序列,构建载体并转化E.coli ER2566,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳进行鉴定.其次,通过单因素实验,对不同温度、转速和补料速度等发...     

黄粉虫中提取纯化超氧化歧化酶的工艺研究

本研究以黄粉虫粉为原料,经盐析沉淀,DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和Sephadex G200凝胶过滤层析等纯化步骤,获得了其中的一种超氧化物歧化酶(SOD)。酶的纯化倍数为78.3倍。SDS-PAGE电泳显示为均一的蛋白谱带。经鉴定该酶为Cu.Zn-SOD。本研究为从黄粉虫中提取SOD提供了一种较好的工艺。     

Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。     

重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究

目的 研究重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）的纯化条件。方法 超声法破碎细胞,用热变性方法沉淀蛋白质;优化DEAE离子交换层析的的分离条件,并用葡聚糖凝胶G100分子筛分离纯化蛋白质。结果 菌体破碎最佳超声功率为300W,超声70个循环,粗酶液热处理最佳温度为75℃,时间10 min;DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0,洗脱液NaCl含量为0.1 mol/L,G100纯化后,rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg,纯化倍数是粗酶液的5倍。结论 得到了适于分离纯化rhMn-SOD的较简便的工艺。