乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化

目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。     

乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性分析

目的分析乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)及武汉生物制品研究所有限责任公司《乙型脑炎减毒活疫苗乳鼠返祖传代试验及小鼠脑内致病力试验SOP》,对随机抽取的28批乙型脑炎减毒活疫苗进行乳鼠返祖传代试验的脑内致病力检测,同时测定发病乳鼠脑组织悬液的病毒滴度,并应用SPSS 13.0软件对28批疫苗病毒滴度、发病乳鼠脑组织上清病毒滴度及发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力检测结果进行Kendall相关性分析。结果 28批乙脑减毒活疫苗病毒滴度为6.0~7.1 Lg PFU/ml,发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力(LD50)均低于3.0 Lg LD50/0.03 ml,发病乳鼠脑组织上清病毒滴度为5.8~7.0 Lg PFU/ml。发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力与疫苗滴度及发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间不存在相关性,而疫苗滴度与发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间低度相关。结论乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定,乳鼠传代返祖试验及其判定标准科学严谨,用于疫苗的质量控制是可行的,进一步表明SA14-14-2株遗传稳定性良好。     

乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列稳定性分析

目的分析2003²011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.722011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.72⁷.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.027.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.02⁷.61 lgPFU/ml。结论连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定,一致性良好,该疫苗质量稳定,安全可靠。     

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒株(SA_(14)-14-2)的稳定性研究

流行性乙型脑炎病毒弱毒株经原代地鼠肾细胞连续传至17代后,毒株蚀斑形态与低代次毒株相似,均为一致的小斑,直径为1mm士,边缘整齐;高代次毒株对成龄小鼠的神经内和神经外毒力未发现增高现象;乳鼠脑内返传一代和返祖试验均未发现高代次较低代次毒力明显升高;不同抗原性的单克隆抗体在与低代和高代次弱毒株的免疫荧光反应中未发现抗原位点变化。     

应用Vero细胞生产乙型脑炎减毒活疫苗

<正>乙脑减毒活疫苗副反应小,注射针次少,但乙脑减毒括疫苗在生产过程中由于使用地鼠肾细胞,存在动物源性的各种污染和变化因素不易控制。所以我们尝试使用传代细胞制备乙脑活疫苗。方法是将乙脑SA14-14-2毒株接种于长成致密单层的Vero细胞瓶中,加入无血清维持液,35℃培养,于     

流行性乙型脑炎活疫苗11年的流行病学效果

目的 观察连续大面积接种流行性乙型脑炎活疫苗的流行病学效果。方法 连续观察１１年接种 乙脑活疫苗的１８２７１５人次的乙脑发病率。结果１１年内均未出现异常反应,总发病率由接种前的２１．８９／１０万下降 到２／１０万左右,保护率为９８．９９％。结论 进一步证明乙脑活疫苗安全有效。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性观察

目的观察乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗(SA14-14-2)病毒原液及成品疫苗的稳定性。方法取3批乙脑减毒活疫苗病毒原液,分别于20～25、2～8、-18～-22及-38～-42℃储存,间隔一定时间取样,检测病毒滴度;将2～8、-18～-22及-38～-42℃储存的在观察末期符合规定的病毒原液制备成品疫苗,观察其于2～8℃储存的稳定性。结果3批疫苗病毒原液在20～25℃储存16h、2～8℃储存12d、-18～22℃冻存3个月及-38～-42℃冻存6个月,病毒滴度均符合《中国药典》三部(2005版)的要求;由2～8℃储存12d、-18～-22℃冻存3个月、-38～-42℃冻存6个月的病毒原液所制备的成品疫苗2～8℃储存24个月,病毒滴度下降缓慢,且热稳定性良好,符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论乙脑减毒活疫苗病毒原液的稳定性随温度的变化而变化,温度越低,稳定性越好;所制备的相应成品疫苗,在观察期内稳定性良好。     

SA_(14)-14-2株乙型脑炎活疫苗流行病学效果观察

本文报道了1～10岁儿童普种乙脑活苗后,乙脑发病率下降情况。结果表明,乙脑活苗接种能使乙脑发病率下降70％左右(P<0.01)。在普种乙脑活苗后的3年中。发生的1～10岁乙脑病例有95％以上未接种乙脑活苗,并出现了乙脑发病年龄上移的趋势(P<0.05),表明乙脑活苗具有较好的保护效果。     

乙型脑炎减毒活疫苗对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫效果

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫反应。方法将乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2)免疫8~12月龄健康儿童,采集免疫前及免疫后28 d静脉血,分离血清,采用蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)分别检测血清中对不同基因型乙型脑炎病毒毒株的中和抗体,计算血清中和抗体阳转率。结果乙型脑炎减毒活疫苗免疫后对基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型乙型脑炎病毒毒株均产生了显著水平的中和抗体,血清中和抗体阳转率分别为94%、92%和94%。结论乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后,对不同基因型的乙型脑炎病毒均产生良好的免疫应答。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗国内外不同野毒株的免疫性

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果小鼠免疫1针后均能抵抗国内11株和国外11株乙脑病毒的攻击,保护率均可达90％以上;人体免疫血清对台湾1株和国外9株病毒均有明显的中和作用。结论SA14-142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫性

目的　研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法　用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果　小鼠免疫 1针后均能抵抗国内 11株和国外 11株乙脑病毒的攻击 ,保护率均可达 90 %以上 ;人体免疫血清对台湾 1株和国外 9株病毒均有明显的中和作用。结论　SA14 142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

乙型脑炎减毒活疫苗诱导小鼠的细胞免疫应答

目的探讨乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性。方法以乙脑减毒活疫苗免疫BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,在体外以重组蛋白NS3-1和NS3-2进行刺激,采用酶联斑点法(ELISPOT)检测分泌细胞因子的效应T细胞的频数。结果乙脑减毒活疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞在体外经重组蛋白NS3-1和NS3-2刺激后,可诱导高频数的分泌IFNγ的CD4+和CD8+T淋巴细胞及低频数的分泌IL-4的淋巴细胞;而乙脑灭活疫苗仅诱导低频数的分泌IFNγ和IL-4的T淋巴细胞。结论乙脑减毒活疫苗可在小鼠中有效地诱导NS3-1和NS3-2抗原特异性T淋巴细胞应答,且应答水平显著高于乙脑灭活疫苗。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

乙型脑炎活疫苗与灭活疫苗诱导小鼠体液和细胞免疫应答的比较

应用检测特异性CTL活性的方法检测乙脑活疫苗的细胞免疫应答 ,并以灭活疫苗作对照。结果显示活疫苗免疫小鼠后诱导的CTL均值为 79 2 % ,较灭活疫苗 2 9%高 5 0 2 % ,表明活疫苗具有较强的特异性CTL活性。用同批活疫苗免疫小鼠后其中和抗体效价为 1:5 ,而同批的灭活疫苗为 1:2 0 ,活疫苗的免疫效力 (ID5 0 ) 3 6× 10 6(ml)显著高于灭活疫苗的 4 0× 10 - 4 ～ 4 2× 10 4(ml)。表明乙脑活疫苗诱导的免疫应答中细胞免疫在保护效力中占有重要地位。     

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗单价半成品在-20℃保存的稳定性

目的评价口服脊髓灰质炎减毒活疫苗单价半成品在-20℃保存的稳定性。方法将-20℃保存1～7年的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价疫苗半成品各随机抽取5～11个批次,采用微量细胞病变滴定法进行病毒滴度测定,分析样品的病毒滴度变化。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型单价疫苗半成品保存5年,滴度仍达到《中国药典》三部(2005版)的要求;保存6和7年,Ⅰ型半成品滴度仍符合上述要求,Ⅱ型半成品滴度合格率均为80%,Ⅲ型半成品合格率分别为60%和20%。结论口服脊髓灰质炎减毒活疫苗单价半成品在-20℃下保存具有良好的稳定性,与Ⅰ型、Ⅱ型相比,Ⅲ型稳定性相对较差。     

甲型肝炎减毒活疫苗稳定性的研究

本文对甲型肝炎病毒L－A－1疫苗珠制备的多批减毒活疫苗放置不同温度、不同时间及反复冻融后的疫苗病毒的稳定性进行研究。结果表明,疫苗置－20℃16个月、4～8℃3个月,室温1周,35℃1天,疫苗清度仍达到≥6.5LogTCID50／ml的合格滴度。疫苗置室温3、5天后冻存一周,再放置室温3天,冻存一个月,其病毒滴度无明显改变,表明此疫苗稳定性良好,可耐受一定范围高温。