外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

牙鲆自然杀伤细胞增强因子(NKEF)全长cDNA的克隆及表达分析

采用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）的方法,分离和测定了牙鲆自然杀伤细胞增强因子（NKEF）cDNA的全长核苷酸序列,5’RACE扩增分离得到了400bp左右的片段,3’RACE扩增得到了800bp左右的片段,经过拼接得到了牙鲆NKEF全长cDNA序列。牙鲆NKEF cDNA全长1028bp（不包含polyA）,其中包括67bp的5’非翻译区、597bp的开放阅读框和364bp的3’非翻译区（不包含polyA）,整个开放阅读框编码198个氨基酸。RT—PCR分析表明,NKEF基因在牙鲆不同组织中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。研究结果为提高牙鲆自身免疫防御能力的研究提供了理论依据。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因.牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp,序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子.cDNA全长588bp,包含一个270bp的开放阅读框,编码一个长89氨基酸的前体肽.RT-PCR分析表明:该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高,在心脏、小肠中表达量较低;受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升.牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源,为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据.     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

牙鲆促性腺激素释放激素基因cGnRH-II和sbGnRH的克隆与表达特征分析

采用RACE和RT-PCR方法,从牙鲆脑组织中克隆获得了两种牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II(DQ008580)和sbGnRH(DQ074693)的cDNA全基因序列,其长度为607 bp和395 bp,分别编码85和98个氨基酸的GnRH前体,均包含一个信号肽、具有活性的GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的GnRH相关肽.氨基酸同源性比较表明,牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II与其他鱼类的cGnRH-II基因有较高的同源性,如与鲽科鱼类条斑星鲽的相似性为97.6%,但与哺乳类、爬行类和两栖类动物的同源性较低;sbGnRH与条斑星鲽的相似性为86.7%.采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在成熟牙鲆个体中的表达,结果表明该两基因在脑区、垂体和性腺中皆有表达,但sbGnRH基因的体内表达部位稍多于cGnRH-II.     

具有5+12优质亚基节节麦的低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,对具优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)5 12的节节麦材料AS63进行扩增,得到长度约为900bp和1000bp的DNA片段,克隆测序后获得3个LMW-GS基因序列LMWD-1(GenBank登录号AY841013)、LMWD-2(GenBank登录号AY841014)和LMWD-3(GenBank登录号AY841015)。它们具有小麦低分子量谷蛋白基因的典型结构特征。其中,LMWD-1和LMWD-2具有完整编码区,长度分别为1065bp和972bp,可分别编码333和302个氨基酸残基的成熟蛋白,且第一个半胱氨酸残基均出现在重复区第13位。在重复区,LMW-1的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL,而LMWD-2的两个疏水单元为PIIIL和SVIIL。LMW-1的重复区中还存在一个连续13个Q组成的短肽。LMWD-3由于编码区内存在提前终止密码子,为不表达的假基因。氨基酸序列比较发现,LMW-GS基因的N-末端区序列具有位点特异性,且LMW-1和LMWD-2与普通小麦Gtu-D3位点的LMW-GS基因有很高的一致性。     

甘薯β-淀粉酶cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR技术从甘薯新大紫(Ipornoea batatas Lam cv．Xindazi)块根总RNA中扩增出预期大小的DNA片段(约1．5kb)。将该片段克隆至pMD—T载体,经酶切分析和序列测定后,正向插入的重组子命名为pMD—cAmy,插入片段长1521bp,编码499个氨基酸残基的多肽,分子量55998kD。克隆的β—淀粉酶cDNA与报道的甘薯另一品种Kokei No．14的mRNA有99％的序列相同,与Calystegia sepiumβ—淀粉酶mRNA有87％相同。重组子pMD—cAmy经IPTG诱导后,胞内可溶性提取物经凝胶电泳和活性染色,出现明显的淀粉酶活性带。SDS—PAGE表明,大肠杆菌表达的β-淀粉酶亚基的分子量约为50kD。重组子pMD—cAmy在淀粉平板上形成明显的水解圈,说明甘薯β-淀粉酶cDNA不仅能在大肠杆菌表达,而且能将有活性的β-淀粉酶分泌到胞外。对重组子pMD—cAmy和甘薯块根可溶性提取物的比较发现,大肠杆菌表达的β-淀粉酶与甘薯块根的β-淀粉酶除迁移率不同外,对淀粉酶活性抑制剂EDTA和β-巯基乙醇的敏感性相同。     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段RNEAU-1和RNEAU-2,长度均为513bp,编码171个氨基酸。以RNEAU-1为靶序列,采用RACE方法获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1,该基因包括3411bp的开放读码框,72bp的5′非翻译区(non-translated region,NTR),68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR、NBS、LRR、HD(conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。Southern杂交结果表明,SR1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT-PCR检测表明,SR1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA为模板扩增得到长度为3972bp的SR1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR1基因在GenBank上的登录号为AY193892。     

斜带石斑鱼生长催乳素基因全长cDNA的克隆、表达及其免疫荧光分析

我们从斜带石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到生长催乳素基因(so-matolactin,SL)的全长cDNA片段,其编码区为1644bp,编码231个氨基酸,其中N-端的24个氨基酸肽段为信号肽。运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平,结果表明,该基因在垂体中大量转录,在其他组织中几乎检测不到转录本的存在。选取基因开放阅读框的核苷酸序列插入pGEX-KG载体进行原核表达,在大肠杆菌中表达的融合蛋白的分子量约为50kDa,并以表达的产物为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。采用冰冻切片和FITC标记的荧光染色方法将SL基因初步定位于脑垂体中部,沿着神经组织边缘分布。本研究为深入研究石斑鱼的生长激素／催乳激素家族的进化关系及SL基因的功能奠定了基础。     

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术，克隆得到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)4种孵化酶基因的全长eDNA。4种孵化酶基因分别被命名为GHEl、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明，4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为795bp，都编码265个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在79．6～95．1％之间。种系分析表明，GHEl、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguilla japonica)孵化酶和青鳉(Oryzias latipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT-PCR分析表明，银鲫GHEl、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达，且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT-PCR表明，它们在成鱼组织中不表达。     

大熊猫朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物对,采用PCR方法扩增了大熊猫的朊病毒基因,将其克隆到T-Easy载体,序列测定及分析表明所克隆的大熊猫PRNP基因(GeneBank收录号为AF327449)片段为795bp,编码264个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约28．5ku。与已报道的牛(GeneBank收录号为AF455119)、绵羊(GeneBank收录号为AF367623)的相应序列作比较分析,核苷酸序列同源性分别为99％和83％,其编码的氨基酸同源性均为100％。在所克隆的大熊猫PRNP基因中未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态性位点。     

斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

脆壁克鲁维酵母KFade5，7基因的克隆及其5′非编码区结构与功能研究

通过补偿乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)KlADE5，7基因突变，从脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)基因组文库中克隆了KfADE5，7基因。该基因全长4975bp，编码793个氨基酸，氨基酸序列与已知的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ScADE5，7基因编码区有68．3％的同源度。利用KfADE5,7-lacZ融合基因，对5′非编码区进行缺失分析，发现了具有完整启动子功能的区域，在启动子上游还发现了两个增强转录和两个减弱转录的区域。     

脆壁克鲁维酵母KfADE5,7基因的克隆及其5''''非编码区结构与功能研究

通过补偿乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)KlADE5,7基因突变,从脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)基因组文库中克隆了KfADE5,7基因.该基因全长4975bp,编码793个氨基酸,氨基酸序列与已知的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ScADE5,7基因编码区有68.3%的同源度.利用KfADE5,7-lacZ融合基因,对5'非编码区进行缺失分析,发现了具有完整启动子功能的区域,在启动子上游还发现了两个增强转录和两个减弱转录的区域.     

半滑舌鳎促黄体激素基因克隆和表达分析及其血清浓度测定

利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中促黄体激素(LH)基因cDNA全长序列。该基因全长670 bp,开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸。与其他脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58%～68%。另外,半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点(19～21 NQT)。实时荧光定量组织表达分析表明,LH mRNA在脑、垂体、卵巢等组织中表达,垂体中表达量最丰富,其他组织尤以脑、性腺表达量较高,推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能;实时荧光定量PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定,结果表明,LH mRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的脑、垂体、卵巢3种组织都有表达,但表达水平有差异,在Ⅳ、V期表达量最丰富,说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。利用125I标记的放射免疫测定(RIA)技术检测繁殖周期半滑舌鳎血清LH浓度,结果表明LH在V期含量最丰富,也说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。