小剂量辐照与rhEGF促培养人表皮细胞生长实验研究

通过对人表皮细胞培养方法的研究,叙述了从取材、消化处理标本、贴壁剂和滋养细胞的准备、培养基和培养条件选择到各种生长刺激因子的运用这一过程。并对低传能线密度(let)小剂量照射和重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)对人表皮细胞生长的促进作用作了对照研究,证实了小剂量照射和重组人表皮细胞生长因子对体外培养的人表皮细胞具有     

小剂量辐射诱导淋巴细胞转化适应性反应研究

应用淋巴细胞丝裂原刺激后细胞~3H-TdR参入的方法,研究了小剂量γ射线照射(0～4 cGy)诱导淋巴细胞转化功能的适应性反应;探讨了影响适应性反应表现的几个因素,即D_1剂量、D_2剂量及D_1和D_2照射的时间间隔。结果表明,体外培养24h的人外周血淋巴细胞在小剂量γ射线(0.5～4.0cGy)照射后,均产生了适应性反应,并以1.0cGy的γ射线     

碳离子辐照哺乳动物细胞引起的旁观者效应

用经过碳离子辐照V79细胞的条件培养基(Irradiated conditionedmedium,简称ICM)和与受照射细胞共同培养两种方法,研究了未受照射细胞的旁观者效应。结果表明,ICM法可以明显降低未受照射细胞的克隆形成率;受照射细胞与未受照射细胞共同培养一段时间后,细胞克隆形成率比假定没有旁观者效应时的预期值低,细胞微核率和hprt(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)基因位点突变率与预期值基本相同。推测受照射细胞可能释放出了能对未受照射细胞生长产生毒性的因子,这种因子对未受照射细胞没有明显的致微核和致突变作用。     

小剂量辐射诱导的免疫增强效应及其细胞学机制

在研究小剂量X射线照射对全淋巴细胞刺激效应的同时,探讨了小剂量照射(0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50Gy)对三种单克隆抗体分离出的CD_4~ 、CD_8~ 和B亚群细胞的刺激效应,观察了小剂量照射后的CD_4~ 、CD_8~ 细胞对B细胞功能的影响。结果表明,Panning法分离的各亚群细胞的纯度和存活率均在90％以上,全淋巴细胞在0.10Gy剂量内有刺激作用,尤以0.10Gy剂量点效应最大(为对照组的139.2％);各亚群细胞在0.20Gy照射内,均有刺激效应的发生,CD_4~ 和B细胞在0.10Gy剂量点效应最强(为对照的179.3％和182.5％),而CD_8~ 在0.05Gy点效应最强(为对照的169.6％);相同剂量,CD_4~ 和B细胞的刺激效应大于CD_8~ 。0.50Gy照射则表现出明显的抑制作用。正常CD_4~ 细胞对B细胞具有辅助功能,CD_8~ 细胞对B细胞具有抑制作用,小剂量照射可加强CD_4~ 细胞对B细胞的辅助作用,促进CD_8~ 细胞对B细胞的抑制功能,以0.10Gy照射后这种效应最强,0.20Gy照后仍可观察到这种效应。     

低剂量电离辐射预处理对高剂量辐射诱导的肝癌细胞hepG2细胞周期阻滞的影响

以人肝癌细胞hepG2为研究对象,用流式细胞术测定并分析了低剂量γ射线(5cGy)预照射对高剂量照射(3Gy)诱导的细胞周期阻滞的影响。结果显示：(1)低剂量照射可引起hepG2细胞在G2／M期短暂累积(至照射后4h);(2)低剂量照射促进hepG2细胞的生长;(3)高剂量照射后,hepG2细胞的G2期发生阻滞,而S期只发生短暂延迟;(4)与单纯高剂量照射相比,低剂量照射预处理后4h给予高剂量照射可进一步促进hepG2细胞在G2／M期累积,但预处理后8h给予高剂量可促进细胞通过G2／M期。实验结果表明,低剂量照射预处理对高剂量照射诱导的细胞周期阻滞的影响,取决于两次照射的时间间隔。     

小剂量辐射诱导的免疫增强效应及其细胞学机制

在研究小剂量X射线照射对全淋巴细胞刺激效应的同时,探讨了小剂量辐射(0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50 Gy)对三种单克隆抗体分离出CD_4~ 、CD_8~ 和B,亚群细胞的刺激效应,观察了小剂量照射后的CD_4~ 、CD_8~ 细胞对B细胞功能的影响。结果表明,Panning法分离的各亚群细胞纯度和存活率均在90％以上,全淋巴细胞在0.10 Gy剂量内有刺激作用,尤以0.10 Gy剂量点效应最大(为对照组的139.2％);各亚群细胞在0.2 Gy照射内,均有刺激效应的发生,CD_4~ 和B细胞在0.1 Gy剂量点效应最强(为对照的179.3％和182.5％),而CD_8~ 在0.05 Gy点效应强(为对照的169.6％);相同剂量,CD_8~ 和B细胞的刺激效应大于CD_8~ 。0.5 Gy照射则表现出明显的抑制作用。正常CD_4~ 细胞对B细胞具有辅助功能,CD_8~ 细胞对B细胞具有抑制作用,小剂量照射可加强CD_8~ 细胞对B细胞的辅助作用,促进CD_8~ 细胞对B细胞的抑制功能,以0.1 Gy照射后这种效应最强,0.2 Gy照后仍可观察到这种效应。     

小剂量辐射诱导淋巴细胞转化适应性反应研究

应用淋巴细胞丝裂原刺激后细胞~3H-TdR参入的方法,研究了小剂量丁射线照射(0～4cGy)诱导淋巴细胞转化功能的适应性反应;探讨了影响适应性反应表现的几个因素,即D_1剂量、D_2剂量及D_1和D_2照射的时间间隔。结果表明,体外培养24h的人外周血淋巴细胞在小剂量丁射线(0.5～4.0cGy)照射后,均产生了适应性反应,并以1.0cGy的γ射线照射所诱导的适应性反应最强。随剂量的增大,适应性反应减弱,说明了小剂量辐射诱导适应性反应存在着最适剂量范围。D_1(1.0cGy)照射后6,24,48,72h照射D_2(3Gy),结果表明24h的间隔适应性反应最强,这与照后细胞的增殖周期有关。1～7Gy的D_2照射,均可观察到适应性反应,而以3.0Gy照射后反应最强。D_2剂量过大,适应性反应不明显,剂量过小,适应性反应显现不充分,说明D_2剂量在适应性反应中亦有最适剂量范围。     

小剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节的影响

应用单克隆抗体铺皿法,从人外周血中分离出CD_4,CD_8,CD_(19)(B)和CD_(57)(NK)四种淋巴细胞亚群,观察了各亚群细胞的肿瘤杀伤活性和相互调节以及小剂量辐射对CD_(57)细胞功能和亚群间调节的影响。结果发现,以上四种淋巴细胞亚群均具有肿瘤杀伤活性,其中以CD_(57)细胞的杀伤活性最强。CD_4和CD_(57)细胞混合培养后的总NK活性超过两者之和,而CD_8,CD_(19)分别与CD_(57)细胞混合培养后,总NK活性与两者单独培养之和相比无显著性差异。50cGy和80cGy的γ线照射可使CD_(57)细胞的功能增强。照射CD_4或CD_(57)细胞后二者混合培养的总NK活性比未受照的混合培养组显著升高。而CD_8或CD_(19)分别与CD_(57)混合培养则无此现象。表明小剂量辐射可增强CD_4和CD_(57)细胞间的协同作用。外周血NK细胞受到多种亚群细胞的影响,外周血NK活性反映了多种细胞自然杀伤活性的总和。     

EGF和EGFR在急性放射性皮肤溃疡组织中的表达水平:与单纯伤口愈合的对比研究

为研究表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)在急性放射性皮肤溃疡组织中的表达水平及对溃疡形成、发展、愈合的影响，采用雌性Wistar大鼠，以^60Coγ射线局部照射法建立急性放射性皮肤溃疡动物模型，并以手术法建立单纯皮肤伤口动物模型，观察病变55d，采用免疫组化、原位杂交和图像分析等方法检测单纯伤口及皮肤溃疡组织中EGF及其受体的转录和表达水平。结果表明，照射后14d照射野内开始出现皮肤溃疡，之后逐渐扩大、融合、加深。皮肤受照射区多种细胞，特别是溃疡床表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞中EGF及其受体的转录及表达水平均较正常皮肤组织有所增强，但与单纯伤口组比较，溃疡组织中EGF及其受体的转录及表达水平明显降低。说明辐射诱导的皮肤溃疡组织中EGF及其受体表达水平降低可能与溃疡发生、发展及难愈合的分子机制相关。     

腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取~(131)I-FIAU的实验研究

用内部核糖体进入序列(IRES)将报告基因单纯疱疹I型病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)连接,双启动子法将TK-IRES-BDNF与增强绿色荧光蛋白(EGFP)包装到重组腺病毒载体中,得到Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,扩增、纯化、测定病毒滴度;以感染复数(MOI)为0、50、100、150、200、250感染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),以重组腺病毒Ad5-EGFP为无效对照病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的绿色荧光细胞阳性率。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染细胞增殖能力。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)诱导感染细胞向神经元细胞分化,显微镜下观察细胞形态变化。实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和2-△△CT法分析两目的基因的相对表达量(CT)。观察感染细胞对131I-FIAU的摄取情况。重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在MOI为150可高效感染BMSCs,感染细胞存活率98%,且保持良好的神经元细胞诱导分化能力。RQ-PCR检测两目的基因随着腺病毒MOI增加表达增强,且TK和BNDF两基因的表达有良好的线性相关(r=0.973,P0.05,n=3)。在前3h可见感染目的基因组细胞对131I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关,3h感染目的基因组对131I-FIAU摄取率可达(31.42±0.46)%(n=3),随后增加不明显。各点感染目的基因组摄取率均显著高于对照组(t=23.06–173.83,P0.05,n=3)。重组腺病毒载体能高效、低毒感染BMSCs,IRES介导两目的基因表达有良好的线性相关。本研究表明感染目的基因细胞可有效介导HSV1-TK摄取131I-FIAU,为后续放射性核素报告基因活体显像示踪转基因BMSCs治疗脑梗死提供了细胞水平依据。     

12C6+离子束照射不同肿瘤细胞显示重离子治疗癌症的明显优势

通过观察两种人恶性肿瘤细胞(人肝癌细胞SMMC-7721和人黑色素瘤细胞A375)对高LET12C6 离子和γ射线辐照的敏感性及其差异,考察重离子治疗肿瘤的可行性及优势.以这两种体外培养的来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞为实验对象,分别进行12C6 和γ射线0-6Gy内不同剂量点的单次和分次照射,采用克隆存活法统计细胞的存活分数.结果显示,无论是单次还是分次照射,12C6 照射后两种细胞的存活分数均明显低于γ射线照射,而且两种细胞的辐射敏感性差异明显降低,同时分次照射细胞的存活分数没有明显提高.结果表明,高LET重离子照射对肿瘤细胞能明显提高杀伤能力,同时降低了不同细胞辐射敏感性的差异且导致细胞低的修复.以上特点与重离子剂量深度分布相结合,使得重离子在治疗肿瘤时具有特殊的优势.     

电离辐射对神经干细胞分化的影响

为了研究电离辐射对神经干细胞分化的影响,用无血清培养技术对神经干细胞进行培养,在传代后将神经干细胞分为4组,分别用0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gyγ射线进行照射,在不撤除EGF、bFGF条件下对细胞进行培养,7d后用免疫荧光方法对细胞进行巢蛋白(Nestin)检测。用同样的方法对神经干细胞进行照射,在培养基撤除EGF和bFGF后,用免疫荧光对神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测。培养的神经干细胞在经一定剂量射线照射后,与空白对照组比较,nestin阳性细胞较未经照射的细胞阳性率降低;经过照射的神经干细胞分化为神经元细胞的比例较未经照射的细胞增加。结果表明,电离辐射具有诱导神经干细胞分化的作用。电离辐射使神经干细胞分化为神经元的比例增加。     

青蒿素与蒿甲醚对人鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏作用的比较研究

为了比较青蒿素(Artemisinin)和蒿甲醚(Artemether)对人鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏作用的差异,取指数生长期的人鼻咽癌CNE-1细胞,采用细胞克隆形成法分别检测青蒿素和蒿甲醚对CNE-1细胞生长的抑制效应,比较两种药物抑制效应的差异性,并确定实验的药物浓度;将人鼻咽癌细胞分为对照组、单纯药物组、单纯照射组及联合治疗组。单纯药物组、联合治疗组分别分为青蒿素组和蒿甲醚亚组,射线照射剂量为0、2、4、6和8Gy,采用多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线,取放射增敏比(SER)为达到相同生物效应时,单纯照射的剂量与联合治疗组的剂量之比。实验结果表明,两种药物对细胞的抑制作用均随着药物浓度的提高而增强,存在剂量依赖关系。青蒿素对CNE-1细胞的抑制作用高于蒿甲醚,测得青蒿素放射增敏比(SER)为1.272,蒿甲醚SER为1.481,表明蒿甲醚较青蒿素对人鼻咽癌CNE-1细胞具有更强的放射增敏作用。     

低剂量UVB辐射对HaCaT细胞凋亡与增殖及Bad信号通路的影响

为研究低强度紫外线UVB(Ultraviolet B,280~315 nm)对人永生化细胞(HaCaT细胞)凋亡和增殖的影响及其与Bad通路的潜在机制,首先通过预实验从3、5和7 mJ/cm2强度的UVB中挑选出5 mJ/cm2强度的UVB分别照射HaCaT细胞18、36和72 h,收集细胞进行细胞凋亡和增殖检测;提取照射后HaCaT细胞的总蛋白进行免疫印迹实验检测AKT、Bad和Bad-p153的表达。结果表明,5 mJ/cm2强度的UVB照射HaCaT细胞18、36和72 h,对HaCaT细胞的凋亡没有影响,但是照射72 h可以促进HaCaT细胞的增殖;免疫印迹实验证实UVB照射后Bad的表达量维持正常,而AKT和Bad-p153表达升高。说明长时间5 mJ/cm2强度的UVB照射可能通过Bad信号通路促进细胞增殖,这可能是皮肤肿瘤发生发展的潜在危险因素。     

低剂量UVB辐射对HaCaT细胞凋亡与增殖及Bad信号通路的影响北大核心CSCD

为研究低强度紫外线UVB(Ultraviolet B,280~315 nm)对人永生化细胞(HaCaT细胞)凋亡和增殖的影响及其与Bad通路的潜在机制,首先通过预实验从3、5和7 mJ/cm2强度的UVB中挑选出5 mJ/cm2强度的UVB分别照射HaCaT细胞18、36和72 h,收集细胞进行细胞凋亡和增殖检测;提取照射后HaCaT细胞的总蛋白进行免疫印迹实验检测AKT、Bad和Bad-p153的表达。结果表明,5 mJ/cm2强度的UVB照射HaCaT细胞18、36和72 h,对HaCaT细胞的凋亡没有影响,但是照射72 h可以促进HaCaT细胞的增殖;免疫印迹实验证实UVB照射后Bad的表达量维持正常,而AKT和Bad-p153表达升高。说明长时间5 mJ/cm2强度的UVB照射可能通过Bad信号通路促进细胞增殖,这可能是皮肤肿瘤发生发展的潜在危险因素。     

H1299旁效应细胞对X-射线辐射的适应性与TGF-β1通路相关

本研究探索辐射诱导人非小细胞肺癌H1299旁效应细胞的适应性反应及TGF-β1通路在其中的作用。采用培养液转移法得到辐射诱导的旁效应细胞,用克隆形成实验检测旁效应细胞受照射后的适应性反应,用Western Blotting检测旁效应细胞中SOD2的表达变化。结果发现:用条件培养液培养H1299旁效应细胞,并不影响细胞的克隆存活率;但是细胞经1 h和18 h未照射条件培养液培养后再接受2Gy的X-射线照射,其细胞存活率较培养于新鲜培养液的细胞受照后的存活率分别增加了12%和38%,经1 h和18 h照射条件培养液培养后的细胞再接受2Gy的X-射线照射,其细胞存活力在此基础上又分别增加了10%;当在照前用TGF-βR1抑制剂SB431542处理信号细胞后,旁效应细胞的适应性反应不再发生;而将SB431542直接加入条件培养液中,并未影响1 h条件培养液诱导的适应性,但是用含有SB431542的18 h未照射和照射条件培养液培养过的旁效应细胞经2 Gy照射后,其克隆存活率较未加SB431542组分别降低了28%和18%,18 h未照射和照射条件培养液组间差异却增大至24%;旁效应细胞经照射条件培养液培养3 h或5 h后其SOD2表达下降。以上结果表明经条件培养液培养后旁效应细胞对X-射线照射产生了适应性反应,照射条件培养液与未照射条件培养液相比,进一步增加了这种适应性,并且TGF-β1信号通路对该适应性有重要调控作用,而SOD2可能未参与这个过程。     

~(60)Co γ射线照射K562细胞后培养基转移介导的旁效应研究

通过培养基转移实验,观察人红细胞系白血病细胞(K562)受60Coγ射线照射(0.5、1.0、2.0、5.0和8.5Gy)后的条件培养基(ICM)对未受照细胞的损伤情况,用健康人外周血自然杀伤(NK)细胞活性的变化来间接反映,并观察了未受照的K562细胞的凋亡率。结果显示,以受照后K562细胞的培养基去培养未受照的K562细胞,检测到其对NK细胞的敏感性明显升高,未受照的K562细胞的凋亡率明显升高。提示辐射引起的旁效应现象,初步分析了旁效应的剂量学特征和时间效应特征。     

培基介导的辐射旁效应及机理初探

采用ICR小鼠,转移受照射细胞的条件培养液来培养未受照射细胞,检测YAC—I（小鼠T淋巴瘤）细胞对小鼠自然杀伤（NK）细胞的敏感性变化,测定小鼠脾细胞增殖能力,观察自由基清除剂二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）照射前处理细胞的影响。初步研究了电离辐射旁效应（Bystander effect,BE）及其可能的机理。结果显示,条件培养液培养的Yac—I细胞对NK细胞的敏感性明显升高。用条件培养液培养的小鼠脾细胞的增殖能力也明显受到抑制,提示辐射旁效应的存在,观察到DMSO对旁效应有一定的抑制作用,说明活性氧（Reactive oxygen species,ROS）等自由基对旁效应有一定贡献。然而在淋巴细胞增殖实验ICM＋1％DMSO组的数据显示DMSO对旁效应的抑制作用非常有限,表明除自由基外必定存在其他因素介导旁效应的发生。     

小剂量X射线诱导EL—4细胞凋亡及G1期阻滞的适应性反应

采用流式细胞术观察了小剂量Ｘ射线预照射对其后大剂量照射所致ＦＬ－４细胞凋亡及细胞周期的影响。证实了０．０７５Ｇｙ预照射可明显降低其后２Ｇｙ所致细胞凋亡，减轻Ｇ１期阻滞，并促进细胞ＤＮＡ合成，说明小剂量辐射可诱导ＥＬ－４淋巴瘤细胞凋亡及Ｇ１期阻滞的适应性反应。     

三株肿瘤细胞对X射线辐射敏感性的比较

比较研究X射线对人子宫颈癌细胞(He La)、人肝癌细胞(Hep G2)和人粘液表皮样癌细胞(MEC-1)的辐射敏感性。X射线照射三株细胞至吸收剂量2、4、6、8 Gy后0.5、4和24 h,用克隆形成实验测定细胞增殖,中性彗星电泳法检测DNA双链损伤(DNA double strand breaks,DSB),免疫荧光染色法检测磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)焦点的形成。结果显示:2、4、6、8 Gy剂量组及照射后不同时间点均以Hela细胞的存活分数(Survival fraction,SF)最高;CASP软件分析显示,DSB增加呈现时间和剂量依赖关系,照射后4 h尾矩(Tail moment,TM)增加最为明显,其中以MEC-1细胞增加最为显著;照射后0.5和4 h,γH2AX阳性细胞率达到100%,照射后24 h逐渐下降,其中Hela细胞下降最为明显。结果提示,克隆形成实验、中性彗星电泳和γH2AX焦点检测法的联合使用能有效预测肿瘤细胞辐射敏感性。