花生中主要过敏原Ara h1的纯化

为了得到花生中引起过敏反应的主要致敏成分Ara h1,以新鲜花生为材料,通过粉碎、脱脂、硫酸铵分步盐析等方法进行粗提;并用离子交换柱以及凝胶柱等方法来进一步纯化过敏原Ara h1。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了纯化后的过敏原Ara h1的纯度,并用高效液相色谱法测定其纯度达到90%以上。      

花生主要过敏原Ara h1的纯化

采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法,纯化花生主要过敏原蛋白Ara h1,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合免疫印迹实验(Western-Blotting)进行鉴定。结果表明：可纯化出纯度90%以上的Ara h1过敏原蛋白。     

花生致敏蛋白Ara h1和Ara h2纯化鉴定方法研究进展

对主要花生过敏蛋白Ara h1和Ara h2的提取纯化方法以及纯化后Ara h1、Ara h2的鉴定方法进行了综述。     

花生过敏原Ara h 6的分离纯化及鉴定

为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/ 电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。     

重组花生过敏原Ara h 2生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h 2。通过RT-PCR 合成cDNA,并以此为模板进行PCR 扩增目的基因Ara h 2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-T Simple 载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h 2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1 表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h 2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL 中,经IPTG 诱导表达。SDS-PAGE 电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B 凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h 2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting 分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h 2 兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。     

基于表位预测的花生过敏原Ara h 6 免疫交叉反应性研究

为了探讨花生过敏原Ara h 6 与其他同源蛋白之间的交叉反应,通过各种生物信息数据库(Genbank,DiscoTope)以及网络工具及软件(BLAST,NPS@和Protean,Clustal x,PyMOL),开展基于表位预测的Ara h 6交叉免疫反应性研究。结果表明：肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118 区域可能是Ara h 6 的线性表位优势区域;Ara h 6 的构象型表位优势区有4 个,它们存在的区域为AA1～13、35～51、53～59、89～105;基于线性表位预测的15 种蛋白质与Ara h 6 可能具有交叉反应性,其中4 种(Ara i 6,conglutin,Ara d 6 和conglutin 8)发生交叉反应的概率为100%;基于构象型表位预测的17 种蛋白质与Ara h 6 可能具有交叉反应性,其中4 种(Ara i 6,conglutin,Ara d 6 和conglutin 8)发生交叉反应的概率为100%。本结果对进一步了解Ara h 6 的过敏性以及指导开展食品中Ara h 6 的免疫学检测具有重要作用。     

花生致敏蛋白Ara h2提取纯化及免疫分析

对花生致敏蛋白Ara h2的提取纯化方法进行探究以及对纯化后的花生致敏蛋白Ara h2的免疫特性进行鉴定,以建立得率较高、操作简单的蛋白纯化方法。     

花生过敏原Ara h 2.02 二级结构和B 细胞抗原表位预测

为预测花生过敏原Ara h 2.02 的二级结构和B 细胞抗原表位,通过Genbank 数据库搜索到Ara h 2.02 基因,并推导出其相应的氨基酸序列,采用SOPMA 和DNAStar 软件预测该蛋白质的二级结构以及通过Jameson-Wolf 法、Kyte-Doolittle 法、Emini 法和Karplus-Schulz 法分别预测其抗原指数、亲水性、表面可性、柔韧性等参数,并综合分析预测该蛋白的B 细胞抗原表位。结果表明：在序列28～31、56～73、76～90、92、148、156～158、168～169 区域最可能是Ara h 2.02 蛋白的B 细胞抗原表位的优势区域。该结果将为寻找Ara h 2.02 的最佳优势表位提供支持,同时为该蛋白单克隆抗体的制备等研究提供理论依据。     

质谱法分析烘焙对花生过敏原Ara h 1潜在致敏性的影响

为研究烘焙对花生过敏原Ara h 1潜在致敏性的影响,采用高离液序列盐溶液从鲜花生和烘焙花生中提取总蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析烘焙前后蛋白条带变化情况,并对其中的花生主要过敏蛋白Ara h 1条带进行质谱和Swiss-Model模型分析.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,烘焙花生蛋白出现...     

实时定量PCR技术检测食品中花生过敏原Ara h1基因成分

采用Taqman探针PCR技术,建立食品中花生主要过敏原基因Ara h1的检测方法.根据GenBank提供的Ara h1基因(序列号AF432231)中一段DNA序列设计特异性引物与Taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-CT标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因.此标准曲线在1.5×103copies～1.5×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.9759;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致.     

花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定

花生过敏由于其高致敏率和致敏严重性而引起了人们的广泛关注。Ara h 1是花生中的主要过敏原,属于Cupin超家族,通过抗原表位识别结合免疫球蛋白E引发花生过敏。本研究采用生物信息学分析花生主要过敏原Cupin超家族Ara h 1线性B细胞表位氨基酸组成,及其与Ara h 1二级、三级结构之间关系,通过质谱分析Ara h 1氨基酸序列中的抗消化肽段,并分析抗消化肽段与预测线性B细胞表位的关系。结果表明,Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸和带电氨基酸;其二级结构没有明显的分布规律,具有一定的回转折叠结构;分析Ara h 1三级结构发现,表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域,部分表位埋入三聚体构象内部;Ara h 1抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上,质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段并结合表位生物信息学分析可以作为鉴定Cupin超家族线性B细胞表位的新方法。     

花生致敏原Ara h 1的重组表达与纯化

Ara h 1是花生中含量最高的过敏原,也是致敏性较高的蛋白之一。目前提纯Ara h 1的方法大多涉及2至3步柱层析,步骤繁琐且成本较高。本文中,将带有6×his标签的Ara h 1基因与pET-32a表达载体融合,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS,诱导使其表达目标蛋白。菌体裂解后使用Ni-NTA吸附、梯度洗脱对Ara h 1进行纯化。采用质谱及Western-blot鉴定纯化蛋白的种类及免疫活性。结果显示,质粒中目标基因的序列与NCBI数据库中Ara h 1的基因数据相符;300 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷22℃诱导菌液22 h时蛋白表达量最高;添加15 mmol/L十二烷基磺酸钠可将蛋白释放到上清液中,使用含50,100mmol/L咪唑的洗脱液分别洗脱2次和1次后得到纯度较高且免疫原性良好的重组Ara h 1。     

阴离子交换层析法分离纯化花生主要过敏原Ara h1的研究

Ara h1蛋白是花生的主要过敏原蛋白。本研究从天然的花生提取花生蛋白质,通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法纯化花生主要过敏原Ara h1。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白纯度,结合免疫印迹实验对Ara h1免疫活性进行鉴定。结果表明：采用阴离子交换层析法纯化出的Ara h1纯度达到90%以上。得率为23.1%。免疫印迹实验表明,此方法纯化出来的Ara h1仍具有免疫原性,能跟花生过敏病人血清特异结合。     

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta（DE3）宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。     

离子交换层析法分离花生过敏原Ara h2的研究

为了制备出花生中重要过敏原Arah2,以生花生为材料,采用脱脂、离心、膜透析、离子交换层析等方法,纯化花生过敏原Arah2。结果显示,采用阴离子交换层析方法,制取的Arah2蛋白纯度达90%,得率为21.9%,该方法为过敏原Arah2的分离研究提供了可行的实验参数。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。