受激辐射损耗超分辨成像技术研究

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术,它能够突破传统光学衍射极限的限制,把远场光学分辨率提高到百纳米以内,被广泛应用于生物医学等领域,是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统,实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化,从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明:该系统成像分辨率可达约60 nm,分辨能力远远高于衍射极限。另外,系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像,共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。     

利用受激发射损耗(STED)显微术突破远场衍射极限

远场光学显微镜受衍射极限分辩率的限制，而近场光学显微镜由于缺乏层析能力，则无法实现超分辨的三维成像，研究了既可突破远场光学显微术的衍射极限分辨率又可实现三维成像的成像技术——受激发射损耗（STED），综述了STED的分辨率与STED光的光强，延迟时间、光斑空间分布等主要参数的关系，以及该技术的最新进展和应用前景。     

利用STED方法研究ITX聚合物的复杂超分辨纳米加工

正因为光具有波动性,由于衍射效应的限制,基于传统的双光子荧光成像分辨率只能达到200 nm。1994年Hell第一次提出受激辐射耗尽(STED)显微术,其核心思想是利用受激辐射耗散掉艾里斑边沿区域的激发态荧光分子。从而压缩成像区域的大小,能够获得超越衍射极限的荧光成像。建立了基于STED的纳米结构加工的实验系统、该系统中用800 nm飞秒振荡级输出的80 MHz飞秒脉冲作为聚合光,532 nm连续激光为阻聚合光。532 nm激光经过扩柬,再经过螺旋相位板形成空心光束,用NA=1.4的浸油物镜聚焦激光,得到532 nm空心光束的直径约500 nm,800 nm激光的焦斑直径约200 nm,与国际报道的结果基本相同。未来有望通过STED纳米加工的方法,以及软件方面的更新,使得此技术能完成加工纳米晶体管的目标。     

三维超分辨显微成像技术的研究进展及展望

超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞器结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具,其具有突破光学衍射极限的分辨能力,从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段,对生命科学相关领域具有重大意义.然而,受衍射极限的影响,超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率要更难以提高,这导致实现细胞结构亚百纳米分辨率的三维成像更为困难.从受激辐射损耗显微术和单分子定位显微术这两种主流技术出发,对目前存在的多种三维成像技术进行了原理介绍和特点分析,最后对其未来发展方向进行了展望.     

受激辐射耗尽荧光显微镜的原理与实验装置研究进展

介绍了四能级系统的受激辐射耗尽(STED)荧光显微镜的基本原理。按照时间顺序介绍了面包圈型耗尽光焦斑的实现方法。对于横向分辨率的改善,最初使用了光路偏移法,后来发展到均分相位板法,再到成熟的螺旋相位板法;另外还介绍了半波相位板法对轴向分辨率的改善。从宽带光源激发、连续光源激发、多色多通道、快速成像和双光子激发等方面综述了受激辐射耗尽荧光显微镜实验装置的逐步完善。最后展望了受激辐射耗尽荧光显微镜的发展前景。     

可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微术

基于可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微技术,从原理上打破了原有的光学远场衍射极限对光学系统极限分辨率的限制,在生物、化学、医学等多个学科拥有广泛的应用前景。回顾了近年来超分辨显微研究的历史,综述了目前常见的几种基于可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微方法,详细描述了各自的技术特点并对比了其优缺点,阐述了相关领域内最新的研究工作进展。     

基于时间相关单光子计数的离线式g-STED超分辨显微术

提出了一种离线式基于时间门的荧光受激发射损耗(g-STED)显微方法。基于在强光照条件下荧光寿命缩短的理论模型,在常规STED架构基础上,使用时间相关单光子记数(TCSPC)算法获取图像的荧光寿命信息,离线设置合理的时间门阈值,丢弃短寿命信号数据,对荧光信号有效点扩展函数(PSF)进行压缩,达到超分辨显微的目的。与传统STED显微术相比,此方法所需光功率大幅度降低,减少了荧光漂白及光毒性;离线式处理则同时增加了时间门设置的灵活性。在实验中,使用45mW的连续STED光,最终获取了约80nm的图像空间分辨率。进一步对时间门的设置对获取图像信号的分辨率和信噪比的影响进行了讨论。     

超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限

长期以来,远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤,可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测上具.但由于衍射极限的存在,使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230 nm和1000 nm.为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征,提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求,在远场荧光显微镜的基础上,科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术.例如,采用横向结构光照明提高横向分辨率到约100 nm,利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高5～10倍.然而,直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后,衍射极限才被真正突破,如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30～50 nm的三维分辨率.另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限,甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级.     

亚20nm荧光超分辨显微技术研究进展（特邀）

荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来,经历了多代创新与发展,其空间分辨率已经远超衍射极限,横向分辨率能够达20 nm以下,可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术,并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外,针对分辨率的限制因素,就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨,并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。     

红外近场辐射探测及超分辨温度成像

红外热成像技术通过探测物体自身所发出来的远场红外辐射从而感知表面温度，在军事、民航、安防监控及工业制造等重要领域有着广泛应用。但由于光学衍射极限的限制，红外热成像的分辨率通常在微米尺度及以上，因此无法用于观测纳米尺度的物体。近几年，我们开发了红外被动近场显微成像技术，通过探测物体表面的近场辐射从而极大地突破红外衍射极限限制，将红外温度探测及成像从传统的微米尺度拓展到了纳米尺度。本文将介绍红外被动近场显微成像技术的基本原理及基于此可实现的物体表面近场辐射探测与红外超分辨温度成像研究。     

Strategic Engineering of Sub-5 nm Dyes@CDs Nanoassemblies Platform for Super Resolution Imaging

The design and construction of fluorescence probes with small size, high quantum yield, photostability, and solubility in an aqueous solution to achieve biomarker have become a focus of interest in super-resolution bioimaging application. Herein, four kinds of GFP-like supramolecular nanoassemblies (SNAs) are constructed in a very facile manner by the host–guest interaction between isopercolic acid derivatives (IADs) and cyclodextrin (CD). ¹H NMR, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and single crystal structure well prove the formation of SNAs. Moreover, compared to the initial state, the fluorescence quantum yield of the SNAs is dramatically improved through suppressing nonradiative relaxation pathways and shielding quenchers. The bimolecular exciton–exciton annihilation (bmEA) process under the high pumping fluence has been suppressed effectively. Both the improved gain and the reduced loss facilitate the buildup of stimulated emission and enable the high stimulated emission efficiency of these SNAs. Sub-5 nm IADs@β-CDs-mediated STED imaging exhibits excellent stimulated emission depletion (STED) performance: high photostability, low saturation intensity ( ≈ 0.50 MW cm⁻²), and high resolution (30 nm) under P_STED-775 nm of 109 MW cm⁻². This supramolecular strategy avoids the tedious molecular synthesis process and paves a new pathway for insights into building up novel high-performance STED probes.     

Red AIE Luminogens with Tunable Organelle Specific Anchoring for Live Cell Dynamic Super Resolution Imaging

Lysosomes and mitochondria play an important role in maintaining cell homeostasis. Visualizing the long-term activities of lysosomes and mitochondria on the nanometer scale in live cells is essential for further understanding their functions but remains challenging due to the limitations of existing fluorescent probes, such as aggregation-caused quenching (ACQ) effect, limited signal-to-noise ratio from fluorescence “always on” in the process of targeting organelle and poor photobleaching resistance. Herein, two efficient red-emitting aggregation-induced emission (AIE) luminogens are reported, which showed “off-on” fluorescence characteristic and specific lysosomes as well as mitochondria targeting capability. Owing to their AIE characteristics, a Stokes’ shift larger than 100 nm, good biocompatibility, and excellent photostability, the AIE luminogens have been successfully utilized for high fidelity imaging of lysosomes and mitochondria. By virtue of these two probes, stimulated emission depletion (STED) images of dynamic lysosomal fusion and mitochondrial fission with a high resolution of 65.6 nm are obtained. Furthermore, the interactions between lysosomes and mitochondria in the process of mitophagy are recorded. This study also provides practical guidance for designing specific organelle targeting probes to support live cell dynamic super-resolution imaging.     

超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。     

超分辨成像方法研究现状与进展

光电成像系统受到衍射极限和像元分辨率的制约,但研究者们从未停止过脚步来突破这一限制。本文介绍了近年来开展的各种超分辨成像方法和技术,包括应用于荧光显微成像的受激发射损耗技术、结构光照明技术、光激活定位技术与随机光学重构超分辨成像技术;可应用于显微系统、光存储与眼底成像的光瞳滤波技术与径向偏振光超分辨聚焦技术;应用于空间探测的合成孔径技术、光子筛成像技术、超振荡透镜技术、亚像元技术与焦平面编码技术。主要讨论了以上超分辨方法的原理、实现手段与目前发展水平。     

超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用（特邀）

观察细胞器间动态相互作用,深入分析作用规律,对于揭示生理病理过程现象背后的机制具有十分重要的意义。传统光学显微镜受到由光波波长和孔径造成的衍射极限的限制,无法观测细胞器纳米级精细结构及细胞器间相互作用的动态变化规律。超分辨显微成像技术的出现为细胞器相互作用研究提供了重要手段,在深入揭示细胞器相互作用规律,阐明生理病理现象深层的机制研究中发挥了重要的作用。文中介绍了受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）显微成像、结构光照明显微成像（Structured illumination microscopy, SIM）、单分子定位显微成像（Single molecule localization microscopy, SMLM）技术,并总结了这三类超分辨显微成像技术在细胞器相互作用中的应用与现状,为超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用提供思路拓展。最后,对超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的优势与不足进行分析总结,展望了超分辨显微成像技术在活细胞内细胞器相互作用成像中的需求发展趋势,为光学与医学及生物学的交叉融合发展提供一定的参考。     

掺Yb3+硅酸盐玻璃的制备和光谱特性

为了研究用于高功率激光器的掺Yb3+激光玻璃的制备和光谱特性,采用高温熔融工艺制备了两块碱金属元素含量不同的掺Yb3+硅酸盐激光玻璃,利用相应的光谱仪器测试了两块玻璃样品的吸收光谱和荧光光谱;分析了不同碱金属离子对吸收系数和荧光强度的影响;比较了倒易法和Fuchtbauer-Ladenburg(F-L)法两种不同方法得到的受激发射截面图,得到了Yb3+掺杂玻璃的各个光谱参量和激光参量。结果表明,随着碱金属离子半径的增大,吸收系数和荧光强度减小;样品的吸收截面图与倒易法计算所得的受激发射截面图相似,而与F-L法计算所得的受激发射截面图差别较大,并且倒易法发射截面图中主峰波长较F-L法发射截面图的主峰波长蓝移;最终样品1的增益性能比较好。     

基于结构照明的超分辨荧光显微成像重建算法

由于具有低光毒性、高速宽视场以及多通道三维超分辨成像能力,超分辨结构照明显微术(SR-SIM)特别适合用于活细胞中动态精细结构的实时检测研究。超分辨结构照明显微图像重建算法(SIM-RA)对SR-SIM的成像质量具有决定性影响。本文首先简要介绍了超分辨显微术的发展现状,阐述了研究SR-SIM图像重建算法的必要性;然后介绍了SR-SIM的成像原理,并重点介绍了SR-SIM图像重建算法,包括SR-SIM中频繁使用的去卷积重建算法、SR-SIM校准与重建过程中参数值获取的算法,以及目前发展的超分辨结构照明显微图像重建算法,并介绍了SR-SIM工具箱;最后总结了当前发展超分辨结构照明显微图像重建算法需解决的5个问题。