α-L-鼠李糖苷酶发酵过程放大研究——从5L到30L发酵罐

以产α-L-鼠李糖苷酶(α-L-1,2-鼠李糖苷酶和α-L-1,6-鼠李糖苷酶)的黑曲霉As-pergillus niger WZ001为考察对象,研究了从5L发酵罐到30 L发酵罐的通气量和搅拌转速的放大工艺.通气量按三种准则、搅拌转速按两种准则放大.通过实验验证,优选得到最佳放大准则为:通气量按1.5倍空气表观线速度进行放大、搅拌转速按搅拌桨叶尖线速度放大.在该优化的放大工艺条件下,30 L发酵罐中α-L-1,2-鼠李糖苷酶和α-L-1,6-鼠李糖苷酶的产量分别为2 515 U/mL和3 612 U/mL,达到5L发酵罐的水平.     

从黑曲霉固态发酵产物中纯化α-L-鼠李糖苷酶及酶法制备普鲁宁

本文研究了从黑曲霉固态发酵产物中纯化α-L-鼠李糖苷酶,并探究利用该酶转化柚皮苷制备普鲁宁。用黑曲霉固态发酵柚皮产生α-L-鼠李糖苷酶,通过40%~80%硫酸铵沉淀、疏水层析、亲和层析和凝胶过滤层析,从黑曲霉固态发酵产物中分离纯化得到了1种α-L-鼠李糖苷酶;该酶为单体分子量约为160 k Da;它由二硫键连接的两个肽段构成,其中有一个大肽段分子量约为130 k Da。其水解柚皮苷的最适温度为50~60℃,最适p H 4.0~5.0,米氏常数和最大酶反应速度分别为0.24μmol/m L和312.5 U/m L。用该酶转化柚皮苷制备普鲁宁的最适反应时间为60~90 min,柚皮苷转化率达98%以上。转化产物中普鲁宁的含量在95%以上,普鲁宁的分解产物柚皮素的含量小于5.0%。用从黑曲霉固态发酵产物中纯化的α-L-鼠李糖苷酶制备普鲁宁具有热稳定性好、底物亲和力强、转化率高和副产物少等优点,为开发酶法制备普鲁宁的工艺提供了重要参考。     

α-L-鼠李糖苷酶的研究进展

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。该文综述了α-L-鼠李糖苷酶的来源、分类、特性及应用等。     

耐久肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶的液体发酵培养基优化研究

通过单因素试验及正交试验确定最佳碳源、氮源和无机盐浓度.最佳培养基的基本组成为蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3mmol/L.最佳培养条件为培养温度34℃,发酵时间4d,70mL培养基的接种量为3%.     

多点突变提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体。结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1. 13倍,1. 44倍;在65℃的半衰期分别提高了1. 64倍,1. 64倍;在70℃的半衰期分别提高了1. 88倍,1. 68倍。对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、"-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关。     

山梨醇对黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)热稳定性的影响

提高酶热稳定性是工业酶属性改造的重要目标。山梨醇作为广泛应用于提高酶稳定性的外源添加剂,目前对其影响酶热稳定性的机制仍不明确。因此,作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶（r-Rha1）为研究对象,通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的谱学分析,研究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响机制。结果表明,在60～70℃下,加入山梨醇可改善α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性;在60、65、70℃条件下,加入1.2 mol/L山梨醇可分别将半衰期提高29、25、10倍;圆二色谱和荧光光谱结果表明山梨醇通过增强α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和结构刚性,从而提高其热稳定性。通过探究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响,进一步证明山梨醇提高酶热稳定性的普遍适用性,同时为后续α-L-鼠李糖苷酶的工业应用提供了参考。     

曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶结构特征规律分析

为了研究所有曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构特征,利用NCBI数据库收集到291条无重复的曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列并通过进化树筛选得到21条具有代表性的蛋白序列,通过序列比对分析得到这21条序列相互独立具有可靠的代表性,并利用生物信息学工具对其理化性质、跨膜区、信号肽进行分析发现,曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶的等电点(p I)范围为4.66～7.17,在氨基酸数量、分子量、原子总数上波动较大,其中有10条序列拥有信号肽,1条序列为两次跨膜蛋白,21条序列都为亲水性蛋白;对其进行进化树构建、三级结构建模及结构叠合发现,这21条代表性序列的蛋白结构可以被分成两大类型,第一大类型含有1个(α/α)6桶状结构和在桶底的1个β片层结构,并根据额外含有的β片层数量的不同再被分成4个小类;第二大类型拥有1个(α/β)8结构和环绕在桶装结构域周围的β片层结构,阐明了曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的蛋白结构特征,这有助于更好的明确α-L-鼠李糖苷酶的共性规律,为改造该酶提供理论指导。     

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Rha1的二级结构预测及三级结构模拟

本文研究了酶的结构,有利于进一步了解酶的功能,通过对α-L-鼠李糖苷酶Rha1二级结构分析及三级结构模拟,为该酶进行理性设计提供基础。采用GORⅢ、PHD等九个二级结构预测方法对Rha1的二级结构进行分析和预测。结果显示,Rha1二级结构为23.51%α-螺旋,29.77%β-折叠,46.71%无规则卷曲,具有一个与GH78家族相似的(α/α)6桶状结构域及两个β三明治折叠片结构域。利用Swiss-Model以单模板建模的方法构建了Rha1的三维结构模型。根据二级结构的结果,将Rha1分为三个结构域,利用Modeller 9.15以多模板分段建模、结构域拼接的方法构建了该酶的三维结构模型,并对其进行能量最小化优化。利用Ramachandran图以及Verify_3D评估对两种方法构建得到的Rha1的三维结构模型进行评价,其中Swiss-Model构建得到的模型未通过评价,Modeller9.15构建得到的Rha1的三维模型结构合理,通过评价。α-L-鼠李糖苷酶Rha1模型的构建为今后深入研究该酶的结构与功能奠定了基础。     

黑曲霉DB056发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶培养基的优化研究

目的:优化黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基,提高这两种醇的产量.方法:以α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力为指标,研究碳源、氯源和乳化剂Triton X-100对α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力的影响,优化黑曲霉DB056摇瓶发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基.结果:碳氮源的种类与浓度,乳化剂Triton X-100的浓度对黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶有重要影响;黑曲霉DB056产酶的优化培养基是:柚皮苷3.5 g/L,玉米浆4g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,KH2PO41.0g/L,KCl 0.5 g/L,无水CaCl20.1 g/L,乳化剂Triton X-1001.0%.此时α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力分别为994U/mL和276U/mL,分别比发酵初始培养基提高了42.3%和147.8%.结论:通过培养基优化,大幅度提高了黑曲霉DB056液态深层发酵α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力.     

GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶分子系统进化关系分析

为了分析糖苷水解酶第78家族(glucoside hydrolase family 78,GH78)中真菌α-L-鼠李糖苷酶保守区及进化关系,本研究应用Clustal W2软件对87条GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶进行多重序列比对,利用Block Maker进一步分析,得到了该家族真菌的共有完全氨基酸保守位点及保守区;利用Signal P 4.1 Server对序列进行信号肽预测;应用MEGA 6.0软件对Clustal W2结果进行遗传距离分析并构建分子系统进化树。GH78家族真菌87条序列虽然长度不等,但均包含AHGWSTGPTY、VTLDTGQNVAG和NELSIPTDGAKRD 3个保守区及多个完全保守氨基酸位点;87条序列中29条含有信号肽;属间遗传距离为0.7~48.5,种间遗传距离为0.4~48.5;分子系统进化树并不是依靠菌株来源进行聚类,而是依据是否为胞外酶进行聚类。该研究分析了GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶的保守区及进化关系,为α-L-鼠李糖苷酶的工程改造奠定了基础。     

塔宾曲霉固态发酵产物中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

α-L-鼠李糖苷酶是一种在食品、药品中有重要用途的糖苷酶,但其结构与功能关系尚不明确,限制了优良酶制剂的设计。本文通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和亲和层析从塔宾曲霉固态发酵柚皮产物中分离纯化得到了一种α-L-鼠李糖苷酶,纯化倍数和比活力分别为34和21105 IU/mg,SDS-PAGE测得该酶的分子质量为120 ku;纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶最适反应p H为4.0,最适反应温度为50℃,p H稳定性和热稳定性好;Fe²⁺对酶活有促进作用,Mn²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺对酶有抑制作用;该酶可水解柚皮苷,但对芸香苷和对硝基苯酚鼠李糖的转化率较低,不水解杨梅苷和柴胡皂苷C。以上结果表明纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金属离子影响特性、底物特异性方面具有新颖性,丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系研究素材。      

产α-L-鼠李糖苷酶细菌Bacillus velezensis的筛选及酶学性质研究

L-鼠李糖苷酶广泛应用于食品加工、医药及医药前体的制备。研究从海洋样品中筛选产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,对菌株进行鉴定,并对α-L-鼠李糖苷酶粗酶性质进行测定。通过透明圈平板筛选法从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌菌株DTC03。通过形态学特征、生理生化特性,以及16SrDNA序列的扩增与分析,将菌株DTC03鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。对菌株DTC03α-L-鼠李糖苷酶粗酶液酶学性质进行测定,该酶最适催化温度和pH分别为40℃和pH7.0;在50℃范围内保持1h后,剩余酶活力高于50%;在pH6.0～8.0的缓冲液放置12h后,仍有60%以上酶活。金属离子Ba~(2+)和Al~(3+)对酶有显著激活作用,而Ni~(2+)、Cu~(2+)和Cd~(2+)对酶有显著抑制作用。目前尚未见Bacillus velezensis产α-L-鼠李糖苷酶的报道,研究结果为该酶的进一步研究奠定实验基础。     

α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在毕赤酵母中的表达及应用

α-L-鼠李糖苷酶对天然产物之间的转化具有重要的作用和应用价值.该研究采用毕赤酵母表达 α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE,构建pPIC9K-AnRhaE表达载体,电转化至毕赤酵母GS115和KM71H中,经诱导表达,SDS-PAGE电泳显示GS115更有利于生产AnRhaE酶.AnRhaE酶在45～55℃时酶活力高,最适...     

乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSE-prha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60?℃,Km值为（3.039±0.581）mmol/L,Vmax值为（2.032±0.186）μmol/（min·mg）;PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45?℃,Km值为（2.797±0.132）mmol/L,Vmax?值为（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA）有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。     

真核α-L-鼠李糖苷酶的碳水化合物结合结构域功能架构分析

为了分析位于CAZy数据库的CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的CBM的功能,利用Ex PASy网站和MEGA 6.0软件进行CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的理化性质分析、进化树的构建,发现CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶可被分为三大类,且大部分为疏水性蛋白,氨基酸数量范围为239～377个,分子量(Mr)范围为24540.58～40740.16 u,等电点(p I)范围为3.93～8.74,负电荷残基总数范围为20～29个,正电荷残基总数范围6～33个,原子总数范围为3415～5712,亲水性平均系数范围为-0.077～0.377,;通过Clustal X 2.0程序和Espript网站进行序列比对分析确定CBM67家族真核α-L-鼠李糖苷酶CBM所在的氨基酸区域。采用Discovery Studio 2019软件进行同源建模和分子对接,构建出由12个β折叠组成的α-L-鼠李糖苷酶CBM三维结构,与L-鼠李糖进行分子对接的结果表明CBM能够通过与底物产生强的氢键和范德华力来识别底物,促进酶水解反应的发生。这有助于更好的理解CBM识别并结合底物的结构基础与共性规律,从而为提高CBM的结合力提供理论指导。     

一种棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶的结构及性质特征研究

α-L-鼠李糖苷酶是一种具有重要应用价值的诱导酶。目前,α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系尚不明确。本文以柚皮苷为诱导物培养棘孢曲霉产α-L-鼠李糖苷酶,研究该酶的结构及酶学性质特征。经质谱分析该α-L-鼠李糖苷酶属于棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶A。三维结构模拟发现该α-L-鼠李糖苷酶具有N端β-折叠结构域、C端β-折叠结构域、clan-L(alpha/alpha)(6)-桶状催化结构域以及具有Asp等九个完全保守氨基酸残基,说明该酶属于糖苷酶78家族成员。分子对接发现该酶通过酸碱催化的机制水解柚皮苷。该酶的最适温度50℃,最适pH 4.0,1 mM与10 mM的Ag+、Fe~(2+)及Fe~(3+)对该酶有较强的抑制作用;该酶可以水解柚皮苷、橙皮苷和杨梅苷,其水解柚皮苷的动力学符合典型的米氏方程,Km值为0.23 mM,Vmax为565.1 U/mg。以上结果丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系的研究理论,为开发性质优良的α-L-鼠李糖苷酶提供了信息参考。     

β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶对速溶绿茶粉水溶液香气的影响

速溶茶粉是重要的茶叶深加工产品,酶工程技术是改良速溶茶粉及其加工产品风味的重要途径。为了解β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶对速溶绿茶粉水溶液香气的影响,运用感官检验、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、香气强度值(OAV)方法对酶处理前后的速溶绿茶粉水溶液进行分析。感官评价和GC-MS分析发现,速溶绿茶粉水溶液主要呈焦糖香和甜香;β-葡萄糖苷酶处理后花香、甜香和青草香显著增强,焦糖香降低,顺式-3-己烯醇、香叶醇、己醇、水杨酸甲酯和苯甲醛这些重要的挥发性化合物的含量显著增加;α-L-鼠李糖苷酶处理后速溶绿茶粉水溶液中焦糖香显著降低;两种酶结合处理后青草香和甜香进一步增强,顺式-3-己烯醇和水杨酸甲酯的含量进一步增加。OAV分析发现,速溶绿茶粉水溶液主要香气贡献成分为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-乙基呋喃、柠檬烯和壬醛;β-葡萄糖苷酶处理后主要香气贡献成分为顺式-3-己烯醇、水杨酸甲酯、香叶醇和癸醛;α-L-鼠李糖苷酶对速溶绿茶粉水溶液各成分的OAV值没有显著影响;两种酶联合处理可进一步增强顺式-3-己烯醇的OAV值。以上研究表明β-葡萄糖苷酶可显著改变速溶绿茶粉水溶液的香气,且α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶对增强速溶绿茶粉水溶液的青草香具有协同增效作用,为改良速溶茶粉加工食品的风味提供了技术参考。     

α-L-鼠李糖苷酶以催化活性包涵体形式异源表达及其酶学性质

从解肝磷脂土地杆菌（Pedobacter heparinus）基因组DNA扩增获得两个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G,构建于表达载体pET-28a;将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）进行异源表达,PhRha78E和PhRha78G以不溶性包涵体形式大量表达于沉淀中,每克菌体可分别获得0.42?g和0.39?g含目的酶包涵体的沉淀。酶活实验显示二者的不溶性包涵体具有催化活性,可以催化水解底物对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside,PNPR）,表明二者在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78E和PhRha78G的最适反应pH值相近,分别为6.5和7.0,PhRha78E在酸性pH?4.8仍能保持62%酶活力,而PhRha78G在碱性pH?8.6依然保持72%酶活力;PhRha78E和PhRha78G的最适反应温度却相差很大,分别为60?℃和40?℃,PhRha78E在高温70?℃条件下仍能保持69%酶活力,而PhRha78G在低温20?℃条件下仍有43%酶活力;动力学常数kcat分别为0.18?s－1和0.12?s－1,Km分别为0.55?mmol/L和0.40?mmol/L。本研究揭示新型α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达,蛋白表达量大,二者酶学性质差异较大,可应用于不同的生物催化领域,并丰富了现有α-L-鼠李糖苷酶资源库。     

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷分子动力模拟研究

L-鼠李糖苷酶能够水解柚皮苷生产普鲁宁和L-鼠李糖,可用于柑橘类果汁的脱苦处理。对柚皮苷和黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶进行分子对接,采用分子动力模拟和MM-PBSA结合的方法计算对接复合物的结合自由能,并分析了分子间相互作用以及各个残基对结合自由能的贡献。结果表明范德华作用力是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的主要驱动力,库伦电荷作用和非极性溶剂化能对结合贡献较小。Trp236、Ala340、Ile462、Phe461、Tyr516、Val522、Trp528等是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶和柚皮苷结合过程中形成疏水作用的重要氨基酸残基。在分子动力模拟平衡后的氢键分析中,黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Ser286、Phe465、Pro520残基和柚皮苷共形成了3个稳定的氢键。本研究分析了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的驱动力,以及结合过程中重要氢键及疏水性残基,为蛋白质工程改造α-L-鼠李糖苷酶提供了靶位。     

溶氧状况对黑曲霉DB056产柚苷酶的影响研究

以α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶的酶活为评价指标,从装液量、玻璃珠数量、氧载体这3个方面来研究黑曲霉DB056摇瓶发酵产柚苷酶的溶氧条件。通过单因素优化得到的摇瓶发酵条件为:装液量35mL、玻璃珠添加个数为3个(直径4mm)、最适氧载体为1%正己烷,在此条件下α-鼠李糖苷酶活力最大可达787.8U/mL,柚苷酶活力最大可达232.5U/mL。