SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段。方法用PCR方法克隆SARSS2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达。表达产物经SDSPAGE及Westernblot鉴定,阴离子交换层析纯化。结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品。结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达

目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。     

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

诺如病毒衣壳蛋白在293T细胞中的表达及纯化

目的在293T细胞中表达诺如病毒衣壳蛋白,并进行纯化。方法将合成的人诺如病毒GII.4悉尼大流行株VP1基因(全长1 623 bp)插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒,测序验证无误后,通过磷酸钙共沉淀法将质粒转染至293T细胞中,收获转染细胞上清,进行Western blot鉴定。转染3~5 d后,收获细胞上清,经氯化铯平衡密度梯度离心纯化衣壳蛋白,收集各组分,离心沉淀病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),PBS重悬后,SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度;电镜观察VLPs;BCA法测定蛋白含量。结果 Western blot分析显示,重组表达质粒转染的293T细胞上清可见特异的蛋白条带。收获的细胞培养上清经氯化铯平衡密度梯度离心后,可见3个明显条带;10%SDS-PAGE分析显示,衣壳蛋白主要位于第3个条带,纯度达95%以上;目的蛋白有2个条带,相对分子质量分别为59 000和56 000;收集的3个组分经电镜观察可见,表达的诺如病毒衣壳蛋白主要位于第3个条带,且组装成了VLPs,颗粒大小约为38 nm;每升培养基可获得约500μg VLPs。结论成功在293T细胞中表达了诺如病毒衣壳蛋白,该衣壳蛋白成功组装成了VLPs。本实验建立了一种小规模制备诺如病毒VLPs的新方法。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。     

狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内的质控方法

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而“即刻法”质控图中一次测定结果处于“失控状态”。结论宜采用双质控方法进行狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化。方法采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95%,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应。结论在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的　为了获得大量重组人血管内皮细胞生长因子（ Ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ, ｈＶＥＧＦ）,以研究其在心血管和药学领域具有的潜在药用价值。方法　用ＰＣＲ方法扩增目的基因ｈＶＥＧＦ１６５,连接到 ｐＥＴ－３ａ载体上,并转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,建立可高效表达的ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ１６５重组质粒,经ＩＰＴＧ诱导表达, Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表达产物的抗原性,通过 Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子层析和ＦＰＬＧ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２分子筛柱层析,进行初步纯化,用 ＭＴＴ法检测其生物学活性。结果 　ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ表达产物经纯化后,其纯度可达到９０％以上,表达的ｒｈＥＶＧＦ１６５能 呈剂量依赖性地促进人静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖。结论组建了天然形式ｈＥＶＧＦ１６５的大肠杆菌菌株,并摸索 出一套纯化工艺,为大规模生产重组ｈＥＶＧＦ１６５奠定了基础。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。     

人脂联素球状结构域(gAd)基因的克隆、融合表达和纯化

目的建立人脂联素球状结构域(gAd)融合组氨酸标签的原核高效表达体系,并分离纯化gAd。方法从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,经T-A克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物,引入起始密码、C端连续6个组氨酸编码序列、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导表达目的蛋白。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的19%,用超声破菌,经金属离子(Ni2+)配体亲和层析一步纯化得到了均一蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定得到了较高纯度的gAd。结论已成功表达了gAd融合蛋白,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。     

重组人G-CSF大肠杆菌表达产物的纯化及鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，并在大肠杆菌中高效表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体可溶性蛋白的25％以上。将其复性后，经CM52离子交换层析纯化，产物经SDS－PAGE分子量测定、肽谱分析、等电点测定表明与天然hG－CSF具有相同性质。免疫印迹证实rhG－CSF抗原特异性良好。用小鼠骨髓细胞集落形成法测定活性达1×108U／mg。     

HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

目的　构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒 ,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件 ,同时分析其二级结构 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法　采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增 ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2 + 金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究 ,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达融合蛋白 (相对分子质量 6 5 0 0 0 ) ,其最高表达量为18 9% ,纯度大于 92 83% ,Westernblot法检测 ,能与HCVNS5b单抗反应 ,证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明 ,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论　HCV聚合酶的高效表达和纯化 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。     

表达含凝血酶识别位点的rhGM-CSF融合蛋白工程菌的选定及其酶切后目的蛋白的纯化

比较 4株表达含凝血酶识别位点的rhGM CSF融合蛋白工程菌的特性 ,选定用于开发的工菌株 ,其表达产物相对分子质量为 2 6 0 0 0 ,N端 110 0 0为MS2 ,C端 15 0 0 0为rhGM CSF ,较易用凝血酶消化释放出目的蛋白。用阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析 ,或后二者结合进行可得到适宜人体应用的纯品 ,活性达到 10 7IU mg蛋白。