生物反应器内微载体培养细胞的胰酶消化放大技术

目的建立生物反应器内微载体上Vero细胞球转球胰酶消化放大技术。方法用500 ml搅拌瓶培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,加入25和37℃消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)消化不同时间,计算细胞回收率及细胞活率,筛选微载体细胞最佳培养温度及消化时间。将3 L反应器内微载体及T25方瓶培养的Vero细胞消化后接种T25方瓶,比较两种传代方式下的细胞形态及比生长速率。将3 L反应器内微载体培养的Vero细胞用消化液消化后,按1∶3、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例接种至15 L反应器,确定最适接种比例。将转瓶及3 L反应器内微载体培养的Vero细胞消化后接种至15 L反应器,比较两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率。结果微载体上培养的Vero细胞经25℃消化15 min可有效保证细胞的回收率及活率。两种传代方式下的细胞形态及比生长速率无明显区别。细胞比生长速率在1∶6~1∶10比例放大时较高。两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率无明显区别。结论初步建立了生物反应器微载体内细胞的胰酶消化球转球放大技术,Vero细胞存活率较高,贴壁良好,空珠率较低,可应用于生物反应器微载体培养系统的规模放大。     

应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。     

生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型

目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×10~5个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达最高,约7.75 TCID_(50)/ml。结论成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础。     

生物反应器微载体放大培养Marc-145细胞及PRRSV增殖情况

目的确定不同级别生物反应器间Marc-145细胞在微载体上消化放大培养条件,实现Marc-145细胞二级放大后,在生物反应器内增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。方法在一级生物反应器(BC-7L型)内,以微载体密度4 g/L培养Marc-145细胞,培养72 h时经灭菌PBS漂洗、胰酶消化后,接种至二级生物反应器(BC-14L型)继续培养,实现反应器间微载体细胞5倍体积增殖培养。以0.05 MOI接种PRRSV(TJM-F92株),接毒后24、36、48、60、72 h分别取上清及全液样品,检测病毒效价(TCID50)。结果 Marc-145细胞经过一级生物反应器培养72 h后,细胞密度达28.7×105个/ml;消化放大后,二级生物反应器培养72 h后,细胞密度达24.9×10~5个/ml。接毒后36 h,样品效价峰值可达108.19 TCID50,上清与全液样品效价差异较小。结论 Marc-145细胞从BC-7L型到BC-14L型不同反应器之间进行放大培养是可行的,为PRRSV活疫苗新型工艺改进及大规模放大生产奠定了基础。     

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。     

生物反应器培养Vero细胞制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗

目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。     

肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

目的建立肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定基础。方法在Cellspin培养系统中对Vero细胞进行微载体培养,考察不同种类培养基MEM、DMEM/F12、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及不同微载体浓度3、5、10 g/L对细胞密度的影响。分别以MOI为0.2及2.0接种EV71至Vero细胞,考察病毒接种量对病毒增殖的影响。分别按培养上清、微载体洗脱液模式收毒,比较不同组分中EV71的抗原含量及TCID50。结果采用5 g/L微载体、VP-SFM培养基时,Vero细胞的密度达4.40×106个/ml;按MOI为2.0染毒,72 h后即可收毒,较MOI为0.2的收毒时间早48 h,按MOI为0.2染毒,收获液上清中的抗原含量达193.5 U/ml,病毒滴度达8.43 Log10TCID50/ml;按上清加洗脱液模式收毒,抗原含量可达573 U/ml。结论成功建立了无血清微载体培养Vero细胞生产EV71的方法,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定了基础。     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

目的 采用Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒。方法 将Vero细胞分别采用无血清和有血清培养基于生物反应器(pH 7.2,温度37℃,溶氧量50%,转数60 r/min)中培养24 h,均用无血清培养基进行灌流培养至7 d,进行计数,并按MOI=0.1接种H1N1型流感病毒,加入终浓度为1μg/mL的TPCK-胰酶,于生物反应器(pH 7.8,温度33.0℃,溶氧量25%,转数60 r/min)中培养18、22、42、48、66 h,取样,检测血凝效价。结果 Vero细胞经无血清和有血清培养基培养7 d的细胞数分别为(133.4±2.0)×10⁴和(193.8±1.3)×10⁴个/mL,接种H1N1流感病毒66 h后血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675,前者细胞数及病毒血凝效价几何平均数均显著低于后者(t分别为7.068和4.332,P均<0.05)。结论 采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养H1N1型流感病毒的血凝效价可满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的　采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法　用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果　培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论　用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。     

不同类型消化液消化Vero细胞的比较

目的比较胰蛋白酶(胰酶)和TrypLE消化Vero细胞的效果,确定细胞工厂培养Vero细胞的最佳消化工艺。方法 10层细胞工厂中Vero细胞生长成致密单层后,分别用(37±1)℃预热的0. 25%胰酶和TrypLE及室温(18～26℃)的TrypLE进行消化,吸取消化后的细胞悬液进行细胞计数,并检测细胞活率。将消化后的细胞悬液接种至生物反应器中继续培养,检测葡萄糖代谢情况,并进行室温TrypLE消化细胞的重复性验证。结果用(37±1)℃0. 25%胰酶、TrypLE和室温TrypLE消化细胞所获得的平均细胞密度分别为1. 70×10~6、1. 68×10~6、1. 65×10~6个/m L,细胞活率均在95%以上。与0. 25%胰酶相比,使用TrypLE消化的细胞再培养时葡萄糖消耗量较高。10层工厂细胞消化所获细胞数的变异系数(CV)为2. 47%,消化传代后Vero细胞培养阶段葡萄糖代谢量的CV均小于10%。结论TrypLE作用温和,消化时细胞损伤较小,重复性好,细胞工厂规模化培养Vero细胞过程中可利用TrypLE替代胰酶进行细胞传代。     

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。     

微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的比较

目的比较微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的效果。方法在7. 5 L生物反应器中,分别使用微载体和片状载体培养MDCK-G1细胞,比较细胞的贴壁效率,并对搅拌转速、初始细胞接种密度、载体量进行优化。结果微载体最适培养条件为搅拌转速55 r/min,初始细胞接种密度3×10^5个/mL,载体量8 g/L,在此条件下最高细胞密度为(5. 03±0. 12)×10^6个/mL;片状载体最适培养条件为搅拌转速120 r/min,初始细胞接种密度2×10^5个/mL,载体量200 g,在此条件下最高细胞密度为(10. 22±0. 69)×10^6个/mL。结论片状载体能够用于MDCK-G1细胞的培养,且相对于微载体可获得更高的细胞密度,但有不易放大的缺点,作为细胞培养系统进一步开发具有很大的应用潜力。