基于外泌体抗肿瘤药物递送系统的研究进展

肿瘤是全球相关疾病死亡的主要病因,尽管现有治疗方法已取得重大进展,但缺乏特异性,且生物利用度较低。外泌体是多泡体（multivesicular body,MVB）与质膜融合时释放介于30～150 nm范围内的脂质双层细胞外囊泡,是细胞间通讯的重要介质,可将蛋白质、脂质、核酸等细胞成分输送至邻近或较远的细胞,从而改变受体细胞的作用。外泌体作为天然纳米载体用于药物输送,可将装载的抗肿瘤药物输送至病灶部位,对各类肿瘤进行针对性治疗,且治疗效果较好。本文对基于外泌体抗肿瘤药物递送系统的优势、药物装载方法及不同细胞来源外泌体在肿瘤治疗中的研究进展作一综述,以期为肿瘤的针对性治疗提供依据。     

外泌体在白血病免疫调节中的作用

外泌体是活细胞分泌至胞外的一种微囊泡结构,携带有亲本细胞来源的核酸、蛋白质和脂质等生物大分子信息,是细胞间的通讯载体。外泌体与肿瘤细胞的免疫逃逸、增殖、迁移与血管生成等恶性生物学行为有关,促使白血病细胞对化疗药物产生耐药以及诱导T细胞凋亡。外泌体促进免疫系统激活,是一种潜在的白血病免疫治疗疫苗。另外,外泌体是发现白血病诊断和治疗生物标记物的一个窗口。本文就外泌体的生物学特性及其在白血病免疫调节中的作用作一综述。     

绿色荧光蛋白标记的BHK-21细胞源性外泌体的构建及鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和外泌体标志蛋白CD63的BHK-21细胞,获得GFP标记的BHK-21源性的外泌体。方法 将慢病毒表达质粒pCT-CD63-GFP与辅助质粒pVS-VG(Env)和pSPAX(structure)共转染293T细胞,包装重组慢病毒,测定病毒滴度后感染BHK-21细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达GFP的细胞。Western blot检测BHK-21细胞中CD63的表达量。取其无外泌体血清培养36 h的稳定转染株细胞上清,获得提取物,经Western blot、透射电镜及粒径分析进行鉴定。将提纯的外泌体与受体细胞BHK-21共培养6 h后,观察外泌体在细胞中的摄取情况。通过Transwell试验检测登革病毒（Dengue virus,DENV）感染后细胞外泌体分泌量的变化。结果 筛选出可稳定表达GFP的BHK-21细胞株,并从细胞上清中提取了外泌体。外泌体存在特异性标志蛋白CD63和CD81;透射电镜下,外泌体呈椭圆形,具有双凹圆盘状膜结构,直径在30～200 nm之间;纳米颗粒示踪分析显示...     

外泌体作为肿瘤诊断生物标志物的研究进展

胃癌、乳腺癌等癌症是导致人类死亡的主要原因之一,通常在晚期才被诊断出来,导致患者错过最佳治疗时机.为实现早发现、早治疗,提高肿瘤患者的治愈率,科研人员在肿瘤的早期诊断和预后评估等方面做了大量研究,发现了包括外泌体在内的多种诊断生物标志物.外泌体是一种由细胞释放的纳米囊泡,在血液、脑脊液等体液中广泛存在,肿瘤细胞释放的外...     

脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞后外泌体的分离及鉴定

目的 分离并鉴定脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞产生的外泌体.方法 培养奶牛乳腺上皮细胞,经20 μg/mL的LPS刺激后,采用超速离心法提取细胞上清中的外泌体,通过透射电镜及Western blot法对分离物进行鉴定,同时以正常奶牛乳腺上皮细胞为对照组.结果 奶牛乳腺上皮细胞...     

外泌体LncRNA在癌症诊断中的研究进展

癌症是世界上造成死亡最普遍的疾病之一,是一种早期无症状的疾病.癌症的发展分为几个过程,包括癌前病变-早期癌-癌症进展期.如果在癌症进展期发现,再进行治疗,患者存活率相对较低.近些年,外泌体越来越受到人们的关注.特别是外泌体作为多种疾病的生物标志物和多种癌症细胞间的通讯媒介,参与癌症的进展、转移、复发和侵袭越来越受到关注...     

鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法。方法从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leuk-ocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoRⅠ酶切及测序鉴定;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1;该方法的敏感性可达101copies/μl;融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好;质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5%。结论已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础。     

小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体的分离及鉴定

目的 分离纯化小鼠原代腹腔巨噬细胞分泌的外泌体并进行鉴定。方法 分别经5只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤,灌洗获得小鼠原代腹腔巨噬细胞后,用流式细胞术分析纯度。采用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体,BCA试剂盒测定外泌体蛋白含量,透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径及分布,Western blot法检测外泌体标志物(CD9、CD63和TSG101)的表达。结果 每只小鼠可获得约5×10⁶个纯度为(99.17±0.65)%的腹腔巨噬细胞。5 mL小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清液中可提取869μg外泌体蛋白。小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体在电镜下呈折光性较强的典型茶托样囊泡,高表达外泌体特异性标志物TSG101、CD63和CD9,粒径分布集中在100～200 nm,平均粒径为175.2 nm。结论 腹腔注射巯基乙酸盐肉汤可提高小鼠原代腹腔巨噬细胞得率,ExoQuick TC外泌体试剂盒能够提取足量且纯度较高的小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体。     

间充质干细胞来源外泌体修复炎症损伤的研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有自我更新和多向分化潜力的多能干细胞,能促进组织修复、再生和血管生成,还具有修复炎症损伤的潜力。MSCs来源外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exos）具有与MSCs相似的免疫调节和组织修复特性,并具有更高的安全性,可作为一种无细胞疗法替代MSCs治疗炎症损伤相关疾病。本文对MSC-Exos治疗炎症损伤的机制作一综述。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

CHO-K1细胞培养上清及其外泌体的蛋白质组分析

目的:确定CHO-K1细胞能否够分泌外泌体,运用液相色谱-质谱联用技术鉴定无血清培养条件下CHO-K1细胞培养上清中的蛋白质和外泌体中蛋白质的成分.方法:将CHO-K1细胞驯化至无血清培养基中,采用exoRNeasy血清/血浆试剂盒提取培养基中的外泌体,透射电镜复染法鉴定其大小和形态,质谱法鉴定标志蛋白;提取培养上清和...     

鼠源性病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的 建立8种鼠源性病毒的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,Q-PCR)检测方法,并进行验证。方法 通过4个实验室验证Q-PCR法的特异性、灵敏度及精密性,同时进行病毒模拟污染试验及盲样检测,并将检测结果进行比对。采用Q-PCR法检测26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品。结果 用于8种鼠源病毒检测的Q-PCR法与同科同属或其他鼠源病毒无交叉反应;除实验室2对鼠痘病毒(又名脱脚病病毒)(ectromelia virus,EctV/Mouse Pox,MPV)检测的灵敏度为2×10²copies/μL外,实验室2对其他7种病毒及其他3个实验室对8种鼠源性病毒的检测灵敏度均为2×10¹copies/μL;除实验室3对鼠腺病毒(mouse adenovirus,MAdV)检测拷贝数试验间CV为37.58%外,实验室3对其他7种病毒和其他3个实验室对8种病毒检测的试验内、试验间Ct和拷贝数CV均<25%。病毒模拟污染试验检测灵敏度均符合参数要求;4个实...     

一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R~2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10~(-3)的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。     

黑曲霉实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法。方法对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性。结果该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测,未发现有交叉反应。结论已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6. 74×10~4～6. 74×10~9 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3. 576 log x+42. 982,R~2=1. 000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。