rAAV/CEA转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤MCF-7细胞系CD44+ CD24-/low乳腺癌干细胞

目的:携带癌胚抗原(carcinocmbryonic antigen,CEA)基因的重组人腺相关病毒(reconstructive human adeno-association virus,rh-AAV)感染树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),体外检测其对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果.方法:分离供者外周血单个核细胞,以细胞因子白介素-4(interleukin-4,IL-4)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导培养获得DC,细胞因子白介素-2(interleukin-2,IL-2),刺激培养获得T淋巴细胞.含CEA基因的rh-AAV感染培养DC,诱导成熟后将DC和T细胞混合培养获得CTL细胞.流式分选MCF-7和MA-MDB-231细胞系中CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,MTT法检测CTL细胞对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果.结果:MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low群比例分别为5.1%和76.3%.CEA基因转染DC诱导的CTL细胞对表达CEA抗原的MCF-7杀伤率为46.5%±15.0%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.009);对MCF-7细胞中分选的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤率为44.7%±28.2%,明显高于未转染组.对非乳腺癌干细胞杀伤率为50.6%±22.2%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.05).在不表达CEA基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞,CEA转染诱导的CTL细胞对未分选细胞、分选的CD44+/CD24-/low亚群和非干细胞亚群的杀伤率与未转染的对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:携带CEA基因rh-AAV转染DC诱导产生的抗原特异性CTL细胞可杀伤表达CEA的乳腺癌细胞,对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞也具有一定的杀伤活性,提示免疫治疗可能是治疗乳腺癌干细胞潜在有效的手段.     

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及其修复缺血缺氧脑损伤作用

目的:研究人脐带间充质干细胞(UCMSCs)多向分化潜能,了解UCMSCs移植治疗脑缺血缺氧损伤(HIBD)大鼠的神经修复功能.方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养人UCMSCs;取第4和10代UCMSCs进行流式细胞术检测间充质干细胞(MSCs)表面特异标志物表达;染色体分型检测染色体是否畸变;进行成神经、骨、脂诱导,了解其多向分化潜能;制备HIBD大鼠模型,穿梭箱测试对照组、HIBD细胞移植组和HIBD组大鼠的主动逃避率(AARR)和未逃避率(NARR).结果:流式细胞术结果显示,类似MSCs样细胞强表达CD29、CD44和CD105,极低表达CD34和CD45,符合UCMSCs的特征.多向分化诱导后的细胞染色和免疫荧光结果显示,UCMSCs可诱导分化为神经样细胞、脂肪细胞和成骨细胞,多次传代后仍可多向诱导,且未发生染色体畸变.穿梭箱测试提示,UCMSCs移植组大鼠在测试的第3、4和5天的AARR高于HIBD组(P<0.05).结论:UCMSCs易获取及纯化,具有多向分化潜能,多次传代功能稳定,可改善脑损伤动物的神经功能.     

牛胎肺间充质干细胞体外培养及生物学特性研究

[目的]建立牛胎肺间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外培养体系并对其进行生物学特性研究.[方法]取3-5月龄牛胎儿肺脏,得到MSCS.通过控制胰酶消化时间,去除难消化的上皮样贴壁细胞,获得纯化的牛肺MSCs,研究其形态、增殖情况及体外诱导分化潜能.[结果]牛胎肺MSCs可在体外扩增培养,传至24代以上,表达CD29,CD44和CD166,不表达CD34,CD45和BOLA-DR,并具有向成骨细胞诱导分化的潜能.[结论]从牛胎肺中可以分离出MSCs,可以在体外培养,并可诱导分化为成骨细胞.     

靶向白血病干细胞CD123的毒性融合蛋白的制备

目的 构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白,检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性.方法 采用PCR法扩增白细胞介素-3(IL-3)和毒素蛋白(LP)的编码DNA序列,经酶切、连接,克隆至表达载体pAYZ,转化大肠杆菌E.coli 16C9,鉴定阳性克隆菌落,经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S-LP,用CM-FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,流式细胞术测定其与红白血病细胞TF1的结合活性.结果 构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达,纯化后纯度达95%以上,表达量约为1 mg/L,并有与白血病干细胞表面IL-3受体α亚基(CD123)特异性结合的活性.结论 构建的融合蛋白IL-3-G4S-LP具有与白血病干细胞结合的特性,可望成为复发和耐药白血病的治疗药物.     

白血病干细胞研究的最新进展

髓系白血病是一种具有多分化潜能的异常造血细胞形成的克隆性疾病,以造血干祖细胞的增殖、分化和成熟异常为主要特征.通过对白血病不同亚群进行研究,研究者发现不同群体的白血病细胞功能不同,有学说认为这种异质性是由白血病干细胞(LSC)形成的.近年来,对LSC的研究提示这群细胞与白血病的起病及治疗有十分重要的关系,文章回顾了近期在LSC起源、免疫表型及在白血病细胞群体中的比例等方面的研究进展.     

化疗后乳腺癌组织中干细胞微球体的分离、培养及鉴定

目的:对从接受新辅助化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织中分离出的化疗微球体(CMSs)进行培养和鉴定,为获取乳腺癌干细胞的新方法的建立提供理论依据.方法:①将获得的CMSs接种在添加生长因子的DMEM/F12培养基中,观察CMSs的生长情况;②通过单克隆形成实验检测化疗微球体细胞(CMSDCs)的克隆形成和自我更新能力;③CMSDCs贴壁培养在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,观察其分化能力;④免疫细胞化学检测CMSDCs及其分化细胞CK14、CK18和CK19的表达;⑤流式细胞术(FCM)检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+细胞的含量;⑥构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型,观察CMSDCs的致瘤能力.结果:CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,3 d后球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可以连续传代形成新的CMSs,新生球体折光性强,表面无坏死层;在添加血清的培养基中的CMSDCs可以分化产生梭形的单层细胞;CMSDCs表达乳腺干细胞标记物CK19,不表达分化标记物CK14和CK18;CMSDCs和分化细胞中ALDH1+细胞的比例分别为为17.41%～23.57%和0.50%～1.28%;103个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠体内形成与原发肿瘤性质相同的移植瘤.结论:CMSs富含乳腺癌干细胞,与悬浮培养所获得的乳腺癌干细胞微球体类似,提示从化疗后的乳腺癌组织中分离癌干细胞微球体可能成为乳腺癌干细胞获取的新途径.     

外周血中自然杀伤细胞分选纯化方法的比较

目的 比较荧光激活细胞分选技术(FACS)及免疫磁珠分技术(MACS)对外周血自然杀伤(NK)细胞分选纯化的效率,为外周血中低比例细胞的深入研究创造基本条件.方法 选择20名健康志愿者及3例造血干细胞移植(HSCT)后早期(+14 d)患者,通过FACS及MACS各自分选其外周血中NK细胞.结果 分选前健康志愿者外周血NK细胞百分数为(12.86±3.62)%,FACS分选后NK细胞纯度达(96.15±2.03)%,回收率为(95.08±2.16)%;MACS分选后纯度达(93.35±3.61)%,回收率为(94.11±3.01)%.移植后早期患者外周血中NK细胞百分数为(11.01±2.08)%,FACS分选后纯度达(96.22±2.16)%,回收率为(95.27±1.18)%;MACS分选后纯度达(90.98±1.94)%,回收率为(94.54±3.52)%.两种方法分选NK细胞纯度差异有统计学意义(t=5.925,P＜0.05),而回收率差异无统计学意义(t=0.789,P＞0.05).结论 FACS较MACS可以更高效、快速、简便地分离纯化外周血中NK细胞,尤其适于分选移植后早期重建的NK细胞.     

原发性扁桃体滤泡性淋巴瘤的临床病理特征

目的:按照WHO 2008年淋巴造血组织肿瘤的最新分类,对原发性扁桃体滤泡性淋巴瘤(FL)的临床特征、形态学和免疫表型进行观察分析,探讨其与淋巴结原发性FL的异同,以利于诊断和鉴别诊断.方法:复习37例原发于扁桃体FL患者的临床资料及诊断切片,免疫组织化学染色后观察LCA、CD20、CD79a、CD45RO、CD3、CD10、Bcl-6和Bcl-2的表达情况.结果:37例原发性扁桃体FL患者中,活检前临床诊断扁桃体肿物28例,扁桃体癌6例,淋巴瘤3例.组织形态与淋巴结内FL类似,滤泡型4例,滤泡和弥漫型1例,少滤泡型32例,无弥漫型.低级别(1-2级)17例,高级别(3级)20例.免疫组织化学染色均表达LCA及B细胞标记物CD20和CD79a,不表达CK及T细胞的标记物CD45RO和CD3.CD10阳性率43.24%,Bcl-6阳性率86.48%,CD10和Bcl-6共表达率为37.83%;22例表达Bcl-2,阳性率59.46%;CD10、Bcl-6、Bcl-2在低级别FL和高级别FL中的表达率比较差异均无统计学意义(P>0.05).2例发生在儿童的扁桃体FL其形态及免疫表型均与WHO新分类的儿童FL相同.结论:扁桃体FL组织形态与淋巴结FL相似,本组活检标本中以少滤泡型为主,高级别占多数.B细胞和生发中心标记物的表达情况与淋巴结FL基本一致,而Bcl-2表达低.     

小儿急性淋巴细胞白血病血清CD3+ CD4- CD8- T细胞和T细胞亚群的变化及其临床意义

目的 探讨小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)外周血CD3+ CD4- CD8- T细胞(DNT细胞)及T淋巴细胞亚群的变化及意义.方法 采用免疫荧光流式细胞术检测30例ALL患儿及24例健康小儿外周血DNT细胞及T淋巴细胞亚群CD3+ T细胞、CD3+ CD4+ T细胞及CD3+ CD8+ T细胞水平.结果 DNT细胞、CD3+ T细胞、CD3+ CD4+ T细胞百分比均明显低于对照组,分别为(4.93±3.75)%比(8.19±3.21)%(t=3.4,P<0.01):(49.99 ±11.70)%比(64.13 ±11.39)%(t=4.1,P<0.01);(28.30 ±7.56)%比(34.61 ±6.43)%(t=3.2,P<0.01);而CD3+ CD8+ T细胞百分比明显高于对照组,为(31.19±9.89)%比(24.33 ±4.24)%(t=3.1,P<0.01).结论 ALL患儿外周血DNT细胞及T亚群的变化提示患儿体内存在免疫功能紊乱,这可能与ALL的发病机制有关.     

人表皮干细胞的分离及其生物学特性的评价

目的:分离人表皮干细胞(hKSCs),并评价其生物学特性.方法:取包皮环切术的正常皮肤,采用酶消化、快速贴壁筛选法分离hKSCs,采用倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞形态,采用细胞免疫组织化学法和间接免疫荧光法检测细胞的分子标志物,利用流式细胞术检测细胞周期.结果:倒置相差显微镜下显示,细胞为多角形,体积小、核大,呈铺路石样排列,形态一致;透射电镜显示,胞质内细胞器稀少,细胞核大,核内具有丰富的异染色质;免疫细胞化学、间接免疫荧光和流式细胞术结果显示,KSCs相对特异性标志物CK15、CK19、P63和CD29呈阳性表达,成纤维特异性标志物Vimentin和表皮终末分化标志物CK10呈阴性表达,RT-PCR结果与上述结果一致;细胞周期检测结果显示,大多数细胞处于G0/G1期,符合hKSCs的慢周期特性.结论:快速贴壁筛选法可分离出纯度较高的hKSCs,可为后续的实验研究提供细胞来源.