具有极高热稳定性的β-（2，6）果聚糖蔗糖酶及其应用

挖掘具有高热稳定性的β-（2,6）果聚糖蔗糖酶（levansucrase,LS）,并应用果聚糖蔗糖酶进行β-（2,6）果聚糖的高效合成。以分子动力学模拟的方式筛选出具有潜在高热稳定性的β-（2,6）果聚糖蔗糖酶。将目的酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中进行重组及诱导表达,并通过镍柱亲和层析进行纯化。在不同温度下进行保温实验以验证LS的热稳定性,并通过条件优化获得产物的高转化率。Cedi-LS在65 ℃时显示出最高活性,远高于已鉴定的其他LS。同时,在45 ℃下保温72 h,重组酶Cedi-LS能够保留90%以上的相对活性;在55 ℃下保温60 h,其保留活性仍可达到初始活性的60%以上,表现出优异的热稳定性。在反应过程中,Cedi-LS可同时生成低聚糖、低相对分子质量的β-（2,6）果聚糖和高相对分子质量的β-（2,6）果聚糖。当温度从65 ℃降至35 ℃时,Cedi-LS倾向于产生HMW-levan,其相对分子质量可达8.4×10⁶。在pH 5.5和35 ℃的条件下,以质量分数30%的蔗糖为底物,加酶量定20 μg/mL,蔗糖转化为β-（2,6）果聚糖的平衡转化率为41.4%。作者鉴定了一种具有高热稳定性的LS,并且这种LS能够高效生产一系列具有不同相对分子质量的果聚糖。     

自选酿酒酵母（KDLYS9-3）产β-D-葡萄糖苷酶动力学研究

自选高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母(KDLYS9-3)在葡萄酒酿造过程中具有增强香气的效果。依据菌体生长和产酶试验,利用Logistic方程、Dose Resp方程和Nelder方程建立了菌体生长和产酶,以及菌体生长速率与酶生成速率之间关系的动力学模型,通过Origin8.0软件进行非线性拟合,并利用Lineweaver-Burk法作图测定了该菌所产β-D-葡萄糖苷酶的动力学参数K_m值和V_(max)值。结果显示:自选酿酒酵母KDLYS9-3的菌体生长与产酶的相关性为部分偶联型,动力学模型与试验值吻合度好,方程能够反映菌体生长与产酶的变化规律。菌体生长8 h后开始产酶,菌体进入对数生长期时酶大量生成,到39 h菌体生长进入稳定期,随着菌体生长进入衰亡期后酶也随之停止产生;利用Lineweaver-Burk法求得酶动力学参数K_m=8.492 579 mmol/L,V_(max)=1.030 715(μmol/L)/min。研究结果为该菌株的理论研究和实际应用奠定了基础。     

人体线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在酿酒酵母中的表达

O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的动态可逆的蛋白质翻译后修饰方式,广泛分布在细胞浆和细胞核中,参与调节多种细胞途径。蛋白质的O-GlcNAc糖基化与许多疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。在体内,O-GlcNAc动态修饰由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)协同完成。OGT具有3种异构体,分别是ncOGT、mOGT和sOGT。目前对于mOGT的功能和调节机制尚未清楚。作者在酿酒酵母细胞中表达了人源的mOGT,发现mOGT抑制酵母细胞的生长。在酿酒酵母细胞中mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性,当其活性位点突变后,O-GlcNAc糖基化活性明显降低,但其同样能抑制酵母细胞生长。作者在酿酒酵母细胞中构建了研究mOGT的系统。可以利用该人源化的酵母筛选和mOGT相互作用的蛋白质和基因,也可以用来筛选抑制mOGT活性的药物,进而研究mOGT的功能与调节机制。     

以UPS构建的重组酿酒酵母表达载体及其稳定性研究

采用通用载体质粒融合系统UPS构建了一种以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体pYES-GFP,并研究了其在重组酿酒酵母中的稳定性。实验表明,所构建的附加型质粒pYES-GFP在经近100代传代后,仍未发生丢失,具有良好的稳定性。同时,通过实验验证了,UPS在进行表达载体构建时快速、简便、高效。     

食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速检测方法。方法:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,以A型肉毒梭菌的A型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以非A型肉毒梭菌,产气荚膜梭菌等23株参考菌株做特异性实验;A型肉毒梭菌DNA稀释成不同梯度,做灵敏度实验。结果:与传统的检测方法相比,该方法具有很好的特异性,方法灵敏度较高,最低检出限可达到为111ng/tube。结论:该方法可以快速、准确检测A型肉毒梭菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。      

蜂王浆中活性因子对衰老小鼠的保护作用

为了探索蜂王浆及其主要的蛋白质类、脂类功能活性因子对D-半乳糖（D-gal）致衰老小鼠的保护作用。实验通过透析、超滤、有机相萃取的方法分别提取分离了蜂王浆中粗蛋白、蛋白质类功能因子及脂类功能因子。通过连续7周每日腹腔注射100 mg/kg（以干质量计） 的D-gal建立衰老小鼠模型,并分别给予蜂王浆及不同剂量的粗蛋白组分、蛋白质类或脂类功能因子干预后,发现蜂王浆可以显著提高小鼠在T-迷宫中的准确率,并且降低肝脏器官指数,证实蜂王浆可能提高衰老小鼠的认知记忆水平,改善小鼠的衰老症状;脂类功能因子及高剂量的蛋白质类功能因子能够显著提高 T-迷宫准确率、缓解肝脏肿大。因此推测,蜂王浆中的蛋白质类功能因子和脂类功能因子都具有良好的抗衰老作用,其机制可能与提高大脑的记忆能力有关。     

植物甾醇+γ-谷维素型凝胶油的制备及其影响因素的研究

以米糠油为油溶剂制备植物甾醇+γ-谷维素型凝胶油,采用流变仪、质构仪、X-射线衍射仪和偏振光显微镜分别研究了凝胶油的流变性、硬度、脆性、晶型、晶体形态等。结果表明:植物甾醇与γ-谷维素质量比为40∶60时所形成的凝胶油硬度最大,熔点最高,脆性最小;随着植物甾醇与γ-谷维素添加量的增大,凝胶油硬度和熔点随之增大,脆性随之减小;甾醇酯和植物甾醇不能使体系凝胶化,甾醇酯的存在会表现出拮抗性,阻碍凝胶的形成,凝胶油的硬度、黏度随着甾醇酯添加量的增加而减小,脆性和熔点则随着甾醇酯添加量的增加而增大,其次,凝胶形成的时间随着甾醇酯添加量的增加而延长;冷却过程中施加一定的剪切会降低凝胶体系的硬度、黏度和熔点,脆性增大;植物甾醇+γ-谷维素型凝胶油为β-晶型,随着储藏时间的延长,其中的纤维网络结构逐渐形成并聚集延伸。     

HPLC测定天然食品保鲜剂中丹参酮ⅡA含量

建立高效液相色谱法测定天然食品保鲜剂（NFP-3）中丹参酮ⅡA含量的方法,为有效控制配方的质量奠定方法学基础。色谱条件为C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,甲醇-1%醋酸缓冲液（85∶15）为流动相,检测波长254nm,流速1.0mL/min,柱温30℃。丹参酮ⅡA对照品在1.0～50μg/mL（R=0.9997）呈良好线性关系。本法简便、准确,线性范围宽,可用于NFP-3中丹参酮ⅡA的质量控制。      

正己烷提取-高效液相色谱法及其串联质谱法分别测定婴幼儿配方奶粉中维生素A、D3含量

目的 建立了正己烷提取、液相色谱和液相色谱串联质谱分别测定婴幼儿配方奶粉中维生素A(VA)和维生素D₃(VD₃)含量的方法。方法 样品中加入VD₃-d₃内标后皂化,正己烷提取,去离子水清洗正己烷提取液以去除提取液中的氢氧化钾,加入氯化钠促进水和正己烷两相分层,将洗至中性的正己烷提取液浓缩至干,甲醇定容至10 mL,取1 mL溶液用液相色谱法测定VA,剩余的9 mL定溶液浓缩至干后再用1 mL甲醇复容,液相色谱串联质谱测定VD₃。结果 VA的线性范围为0.2～6.0 μg/mL,方法检出限为30 μg/100g,方法定量限为100 μg/100g;VD₃的线性范围为0.01～0.20 μg/mL,方法检出限为0.5 μg/100g,方法定量限为1.0 μg/100g。通过质控样品验证方法准确度和精密度,测定值均在质控区间内,且批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均小于5%。使用该方法成功通过了2020年婴幼儿配方奶粉中VA、VD₃样品能力验证考核。结论 该方法所用提取试剂少,且操作简单快捷,适用于婴幼儿配方奶粉中VA和VD₃的测定。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测鸡血浆中头孢噻肟及其主要代谢物

研究头孢噻肟(cefotaxime,CTX)在鸡血浆中代谢规律,建立同时检测血浆中CTX及其主要代谢物去乙酰头孢噻肟(desacetylcefotaxime,DCTX)的超高效液相色谱-串联质谱方法,以10 mg/kg的体质量剂量给药实验蛋鸡,并对给药后不同时间点采集的血液样品,进行CTX及其主要代谢物DCTX含量的检测。结果表明,所建方法中CTX和DCTX的检出限分别为0.07、0.14μg/L;定量限分别为0.23、0.99μg/L。回收率分别为86.7%~95.2%、89.5%~112%,相对标准偏差不大于7.7%,满足残留分析方法的要求;CTX在蛋鸡体内分布迅速,给药后即刻达到峰值(56.34 mg/L),且代谢较快,给药24 h后检测值低于3.0μg/L,而主要代谢物DCTX在给药45 min后达到峰值(10.22 mg/L),消除相对缓慢,给药24 h时检测值仍可达到54.0μg/L。     

酿酒酵母萌发突变株的筛选

酵母细胞孢子作为微胶囊首次运用于酶的固定化,但是由于其孢子遇到营养物质即萌发的性质,导致固定化酶的重复利用率受到限制,因此筛选有萌发缺陷的酵母细胞孢子突变株对微胶囊的应用至关重要。利用EMS对酵母细胞进行诱变再经过乙醚的筛选获得4株萌发突变株AN120-m5、AN120-m8、AN120-m10和AN120-m17。验证后发现他们均产孢正常,除了AN120-m5生长有些弱之外,其余3株生长都正常。后对这些突变株进行了液体培养基以及固体培养基内的验证,实验发现所有突变株都表现出明显的萌发缺陷,其中AN120-m10孢子在液体培养基中萌发率只有1%,而AN120-m5单个孢子在固体培养基上则完全不萌发。由于AN120-m5单个孢子不能萌发因此得不到杂交后代,而其余3株突变株在与野生型杂交三代后,发现野生型孢子与突变型孢子萌发状况相比始终呈现2∶2的萌发优劣比,从而可以推测突变株是单基因突变菌株,为后续研究确定突变基因从而筛选得到完全不萌发菌株打下基础。     

酿酒酵母代谢调控合成功能营养品：进展与挑战

综述了酿酒酵母作为底盘细胞代谢调控合成功能营养品的研究进展。首先,介绍了酿酒酵母作为细胞工厂相关的启动子调控、终止子调控、辅因子调控、转运蛋白调控及动态调控等一系列代谢调控策略,并介绍了加强产物合成的相关遗传改造工具和代谢分析技术。随后,概述了酿酒酵母合成寡糖、维生素及萜类、短链有机酸和脂肪酸等功能营养品的研究进展。最后,提出了目前面临的挑战,并结合代谢工程新兴技术展望了未来酿酒酵母代谢调控的发展趋势,以期为功能营养品在酿酒酵母中的高效合成提供参考。     

酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵 对果酒品质的影响

果酒以其酒精含量低、营养物质丰富、口感风味独特等优良特性越来越受到消费者欢迎。然而发酵过程中酵母菌种类的选择直接影响到果酒的品质。由于非酿酒酵母在发酵过程中能够产生丰富的代谢产物,对增强果酒的营养价值和风味具有积极作用,因此多菌种混合发酵受到越来越广泛的关注。本文综述了混合发酵过程中非酿酒酵母的作用、酿酒酵母和非酿酒酵母之间的相互作用(包括酵母菌细胞之间的相互作用和代谢产物对酵母菌的影响)以及混合发酵对果酒风味、抗氧化活性、色素等品质的影响,为非酿酒酵母在果酒发酵中的应用提供参考。     

酿酒酵母全基因组学及其应用研究进展

文章综述了近年来对酿酒酵母在功能基因组学、比较基因组学、合成基因组学等方面的重大研究进展,并对其继续深入研究的方向及应用开发的前景进行了展望。     

新疆馕用优良酿酒酵母筛选

为了从新疆本地酸奶、酵头和葡萄酒等样品分离的12株酿酒酵母中筛选出制馕优质菌,以活性干酵母及传统酵头为对照,通过起发性实验筛选获得3株优良菌株(J-T111-4、S-S167-1、SC9),并对3株优良菌株的起发性、产酸性、降糖性、繁殖性进行分析,并用排序法进行感官评定火馕坑法制馕特性。得到J-T111-4菌株具有繁殖细胞数高、残糖质量浓度低、酸度低、起发性高、制作的馕具有浓郁馕香、馕滋味突出等特征,确定为制馕优质菌,同时获得制馕口感松软的SC9菌株。     

Multilocus sequence typing of oenological Saccharomyces cerevisiae strains

This study describes the application of a multilocus sequence typing (MLST) analysis for molecular discrimination at the strain level of Spanish wine yeast strains. The discrimination power of MLST is compared to mitochondrial RFLP analysis. Fragments of the ADP1, ACC1, RPN2, GLN4, and ALA1 genes were amplified by PCR from chromosomal DNA of 18 wine Saccharomyces cerevisiae strains. Ten polymorphic sites were found in the five loci analyzed showing 13 different genotypes, with 11 of them represented by only one strain. RFLP analysis of the same 18 wine yeast strains showed seventeen different mitochondrial patterns. Phylogenetic relationships among the strains analyzed, inferred by MLST data, showed wine isolates of S. cerevisiae as a rather homogeneous group. The discrimination potential of mitochondrial RFLP analysis was superior to the MLST scheme used in this work. However, MLST analysis allowed an easy construction of reliable phylogenetic trees. MLST analysis offers the possibility of typing wine S. cerevisiae strains simultaneously to the study of the genetic relationship among them.     

酿酒酵母发酵混合果汁的功能性研究

采用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae KD对苹果、猕猴桃、梨混合果汁进行发酵,研究了该混合果汁发酵过程中酿酒酵母对真菌毒素棒曲霉素的去除作用及其降解产物对大肠杆菌的毒性,并对其发酵过程中的抗氧化能力及对α-淀粉酶、脂肪酶的抑制效果进行分析。结果发现,混合果汁发酵过程中棒曲霉素的含量持续下降直至完全降解,且棒曲霉素的降解产物对大肠杆菌无毒害;对抗氧化能力指标进行检测,发现发酵果汁的DPPH·、ABTS⁺·清除率和还原力相比新鲜果汁分别提高了15.0%、45.9%和9.6%,抗氧化能力显著增强(P<0.05)。此外,混合发酵果汁可以有效地抑制与肥胖相关的α-淀粉酶、脂肪酶的活力,抑制率分别为52.4%和45.2%。本文的研究结果可为开发功能性发酵果汁提供科学依据和技术支持。     

巨噬细胞识别酿酒酵母孢子的研究

酿酒酵母是一种对人类和动物重要的益生菌,在不同的营养条件下有营养态和孢子态两种形态.为了研究酵母孢子对免疫系统的作用,初步探讨了巨噬细胞对酵母孢子的响应机制.通过比较巨噬细胞对营养态酵母和野生型孢子的内吞效率,发现巨噬细胞对野生型孢子的内吞效率更高.通过Syk或PI3K抑制剂抑制实验,发现野生型酵母孢子和营养态酵母的内...     

响应面法优化弗托氏葡糖酸杆菌产羟基乙酸工艺条件

为了构建一株可以生产乙醇酸的食品安全菌株,对枯草芽孢杆菌开展了代谢改造。本研究首先利用同源重组手段将外源异柠檬酸裂解酶基因aceA整合到了枯草芽孢杆菌基因组上,构建了出发菌株164MCT-GA,然后利用代谢工程手段进行了乙醇酸合成代谢优化。结果表明,整合外源异柠檬酸裂解酶基因aceA的出发菌株164MCT-GA可以实现以甘油为底物的乙醇酸从头合成,摇瓶发酵产量为0.114 g/L;在此基础上,过表达柠檬酸合成酶基因（citA）,加强前体物供应;过表达乙醛酸还原酶基因（yvcT）、敲除乳酸脱氢酶基因（ldh）、磷酸乙酰转移酶基因（pta）、乙酰-CoA转乙酰酶基因（mmgA、yhfs）,从而减少碳源损失并提高乙醇酸转化率,最终得到的工程菌GA3-52,其摇瓶发酵产量为0.572 g/L,是出发菌株的5倍以上,产率为0.175 g/g甘油,本研究首次在枯草芽孢杆菌中利用乙醛酸循环进行乙醇酸的从头合成,为食品安全菌高产乙醇酸的发酵生产奠定了基础。