融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。     

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质

基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A~(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly~(320)的密码子GGT突变为Asp~(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A~(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A~(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A~(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A~(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A~(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly~(320)突变为Asp~(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。     

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm~27和Auman5A-R-cbm~27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)~(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。     

引入中性氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

通过对黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2进行生物信息学分析,在N-端区域引入半胱氨酸,定点突变E27C,构建突变基因xyn-E27C,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。酶学性质分析发现,突变酶Xyn-E27C的最适温度为45 ℃,与原酶XynZF-2相比提高了5 ℃。在40 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/240 ℃为100 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=55 min）提高了45 min。在45 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/245 ℃为24 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=7 min）提高了17 min;突变酶Xyn-E27C的最适pH值由5.0提高至5.5,而pH稳定范围均为5.0～9.0。因此,定点突变E27C对木聚糖酶XynZF-2的热稳定性以及最适pH值均有重要影响。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质。方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质。结果成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达。LipB最适反应温度40℃,最适pH 8.5。该酶能在pH 5~7条件下保持稳定,Ca2+有促进酶活性的作用。LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异。结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的 克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质.方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3).硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质.结果 成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达.LipB最适反应温度40℃,最适pH8.5.该酶能在pH5～7条件下保持稳定,Ca<'2+>有促进酶活性的作用.LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异.结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景.     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆出一种糖苷水解酶(GH)26家族β-甘露聚糖酶(AuMan26A)成熟肽编码基因(Auman26A),成功实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的异源表达。重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg。其最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33%;其最适pH为5.5,在pH 5.0~7.0的范围内较稳定;Fe2+和Fe3+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg。reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景。     

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

曲虫治理效果分析

通过对曲虫治理应用研究效果的分析 ,结果表明 :质量效果提高 7% ,糖化力效果提高 80 % ,综合效果提高 92 7%。     

分离高温盐的工艺条件研究

文章利用不同温度下Na ,K ∥Cl-,SO2 -4 —H2 O四元体系相图 ,对通过物理方法分离高温盐中一水硫酸镁和氯化钠的工艺条件进行了分析。得出当循环母液和高温盐配成的浆料温度超过 5 5℃ ,浆料液体中氯化镁达到一定浓度时 ,才能分离出纯净的一水硫酸镁和氯化钠。     

蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella sinensis)菌丝体发酵液免疫活性的研究

对蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液(HSFL)制剂进行体内和体外免疫活性研究。结果表明:该制剂在体外对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞的转化能力显著增加,并且在体外显著提高了小鼠脾脏中NK细胞的活性;在体内实验中,该制剂可以显著改善DNFB诱发的小鼠迟发型变态反应;显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液制剂具有调节免疫的生物活性。      

制革清洁化技术的进展

就皮化材料与清洁化制革的关系、目前传统制革工艺中存在的严重污染问题及针对这些问题近年来采取的新的方法进行了探讨,指出清洁化是我国制革行业的必由之路,清洁化制革工艺与皮化材料的关系非常密切,只有研发出相应新型的、高吸收的、功能型的、易降解型的各类化工材料,才合乎清洁化生产的要求。在制革工艺中采用生物酶制剂辅助浸水脱脂、无硫脱毛与无灰浸碱工艺、无铵脱灰/碱等改造传统工艺,减少污染;采取高吸收铬鞣、无铬或少铬鞣制,提高铬的吸收率或克服铬鞣的弊端;在染整中,合成并采用助剂辅助染料、复鞣剂和加脂剂等的吸收与结合。这几方面通过集成应用,方可减轻制革的污染,实现清洁化生产。同时,就皮革固废物的利用及水的循环使用问题提出些看法。     

核苷酸磷酸基团保护的研究

将谷氨酸钠、5′－磷酸鸟苷按1：1混合后，添加柠檬酸，然后用硬脂酸包覆，能够有效地保护核苷酸5′－位上的磷酸基团。其中，（5′－磷酸鸟苷＋谷氨酸钠）：柠檬酸：硬脂酸＝30.3:9.1:60.6时，5′－磷酸鸟苷的残存率可达93％。     

葵花籽油中酸价测量结果的不确定度评价

目的 分析食用油中酸价测定的不确定度来源并建立不确定度评定方法, 为检验数据的可靠性和准确性提供参考。方法 依据GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》建立数学模型, 计算各变量的不确定度, 最终计算扩展不确定度。结果 结果显示, 样品中酸价的扩展不确定度为U=1.764×10?3 mg/g, 样品中酸价含量为(0.16±0.002) mg/g(置信水平95%, 包含因子k=2)。结论 在测定过程中, 测量重复性对总的不确定度影响最大, 其次是滴定管的体积。     

有梭织机稀密路织疵成因分析

从有梭织机打纬过程中织机构件的位置和状况对纬纱之间距离的影响出发,推导出纬向密度计算公式,直观分析了影响纬向密度的各种因素,提出了为减少稀密路织疵在国产老织机上采取的几项改进措施：采用弹簧回综、机外送经、电子驱动、导布辊加压等装置。     

The basis streamlines of activities of Department of Preventive Medicine of RAMS

The article gives a brief account of the main streamlines and scope of scientific activities of Department of Preventive Medicine of RAMS for the recent 10 years.     

两种脂肪酸聚甘油酯(PGE)的性质比较

脂肪酸聚甘油酯(Polyglycerol esters of fatty acids,简写为PGE)在常温下有半固态和固态两种存在状态,本文通过对分别添加这两种PGE的软冰淇淋基料进行粘度、pH、粒径分析和垂直扫描分散稳定性分析(Turbiscan),发现半固态PGE的添加量为0.2%时,乳状液的粘度最低,粒径最小,稳定性最好;固态PGE的添加量为0.4%时.乳状液的粘度最低,粒径最小.通过比较发现,两种PGE对基料的影响有很大差别:半固态PGE能使乳状液的粒子更小,并能有效延长乳状液的稳定性;而固态PGE由于其熔点较高,可以促进脂肪结晶.