转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

抗生素对根癌农杆菌的抑菌效果及对烟草叶片分化的影响

研究了卡那霉素和6种头孢霉素(头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠、头孢唑啉钠,头孢拉定和头孢他啶)对烟草叶片分化及对根癌农杆菌LBA4404和烟草转化植株的抑制效果。结果发现:不同烟草品种对卡那霉素的耐受性差异较大,品种CV为受体材料时,叶分化和茎段根再生的适宜浓度为50 mg/L。品种T12为受体材料时,叶分化的适宜浓度为100 mg/L,而茎段根再生则为200 mg/L;头孢曲松钠和头孢噻肟钠对根癌农杆菌LBA4404的抑制效果好,并可使继代3次(60 d)的烟草转化植株脱菌;不同浓度的6种头孢类抗生素对烟草叶片的分化影响不大。从头孢类抗生素对农杆菌和烟草转化植株的抑制作用、外植体的分化影响来考虑,在用农杆菌LBA4404作为介导菌株时,可选用200 mg/L的头孢曲松钠或头孢噻肟钠来抑菌。      

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定,再用Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式PCR(Semi-nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因;利用限制性内切酶Hind Ⅲ对半嵌套式PCR产物进行酶切,从而验证半嵌套式PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明,半嵌套式PCR是一种快速、灵敏的检测转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的方法。      

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

农杆菌介导快速、高效获得转基因烟草纯合株系

利用植物表达载体PBI121空载体,对农杆菌介导法转化烟草技术体系进行了综合改进,探索激素配比、侵染时间、分化和生根培养阶段卡那霉素的筛选压对烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)植株再生和转化效率的影响;同时根据孟德尔显性性状杂合子自交后代遗传分离规律,在转基因株系后代扩繁时用卡那霉素筛选分离,可以在T2代较快得到纯合株系.本研究通过使用整个叶片浸染、高的卡那霉素筛选剂浓度、控制生长条件以及强化管理,极大地缩短了获得纯合株系的时间,确立了该烟草品种快速、高效获得大量转基因阳性植株及快速获得转基因纯合株系的转化体系,其转化周期可减少至5-6个月,转基因植株阳性率可达到90％,其中60％的转基因植株后代卡那霉素抗性性状分离比例接近3:1.     

根癌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白融合基因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200μmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。     

杏鲍菇原生质体制备、再生及其遗传转化体系的建立

为优化杏鲍菇GIM5.344 原生质体的制备、再生条件及建立稳定有效的遗传转化体系,对裂解酶、酶解温度、酶解时间、再生培养基稳渗剂等原生质体制备、再生条件以及潮霉素浓度、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）介导转化方法进行优化,探究不同原生质体制备、再生条件对原生质体产量和再生率的影响。结果表明：选用溶壁酶1 进行酶解效果最佳,当酶解温度30 ℃、酶解时间2 h、再生培养基稳渗剂为甘露醇时,原生质体的产量可达到7×108 CFU/mL,再生率达到0.40%。得到转化子最多的转化方法为固体预培养+双层培养法,即PEG 介导转化后在无抗性再生培养基上28 ℃预培养48 h,然后再添加一层含有30 μg/mL 潮霉素的培养基进行拟转化子的筛选。所得转化子中的绿色荧光蛋白基因能稳定有效表达。     

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析

重组克隆ＤＮＡ用ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ双酶切得到马铃薯Ｙ病毒ＮＩｂ基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，叶盘法将ＮＩｂ基因转入烤烟品种ＮＣ８９的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、ＰＣＲ检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株ＤＮＡ中整合了外源目的基因，且表现抵抗２０μｇ／ｍｌＰＶＹＮ的侵染，ＥＬＩＳＡ分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对ＰＶＹＮ侵染具有较高抗性的转基因烟草植株。     

苯乙酸对烟草单倍体植株叶脉组织培养一步成苗的效应研究

本研究探明了苯乙酸(PAA)对烟草单倍体植株叶脉切段培养一步成苗的效应,发现PAA与NAA、6-BA配合使用能有效促进一步成苗的发生。试验证明PAA对一步成苗的促进效应与各种激素浓度配比和基本培养基的种类有关,与基因型的关系不明显。烟草单倍体植株叶脉切段培养一步成苗的最佳培养基配方为MS+PAA 20 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+谷氨酰胺50 mg/L+麦芽糖30 g/L。试验还证明,与2,4-D诱导产生愈伤组织途径的多级成苗培养相比,本研究建立的PAA一步成苗培养具有以下优点:1)显著提高愈伤组织的诱导率;2)显著提高愈伤组织的质量,有效提高愈伤组织分化率;3)成苗率显著高于多级成苗;4)再生植株具有更好的幼苗素质;5)再生植株的染色体数目变异率也显著低于多级成苗;6)获得双单倍体植株的频率显著高于多级成苗;7)能有效缩短培养周期、节约成本。      

基因工程方法抗甜菜丛根病病毒育种的研究：（Ⅰ）甜菜坏死黄脉病毒外 …

采用含有甜菜坏互黄脉病毒外壳蛋白（ＢＮＹＶＶ ＣＰ）基因的农杆菌，分别以不同甜菜品系的叶柄、下胚轴及子叶为外植体材料进行基因转化研究。含有ＢＮＹＶＶ ＣＰ基因和卡那抗性筛选基因的农杆菌与甜菜组织不同外植体共培养后，经过诱导分化培养，在含有卡那霉素的培养基上，从叶柄及下胚轴分别直接诱导出抗卡那霉素再生芽，而从子叶上只诱导出紧密型绿色愈伤组织，未分化出不定芽。从叶柄及下胚轴诱导两生芽的诱导培养基分别为     

An Efficient Regeneration System and Optimization of the Transformation from the Cotyledonary Node of Jute (Corchorus capsularis L.)

The purpose of this study was to use cotyledonary nodes as explants to establish an efficient regeneration protocol for jute (Corchorus capsularis L.) on Murashige and Skoog (MS) basal medium. Research into the different growth regulators using the orthogonal design L16 (4⁵) revealed that the best shoot induction medium is MS medium containing 8% (w/v) agar and 3% (w/v) sucrose supplemented with 1.0 mg/L 6BA and 0.25 mg/L NAA. The average number of shoots per explant and the explant induction rate were 9.8 and 100%. After 3 weeks, 2–3 cm shoots were rooting on 1/2 MS medium containing 8% (w/v) agar and 3% (w/v) sucrose supplemented with 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA. Moreover, we optimized Agrobacterium-mediated transformation using the GUS gene transient expression system. The best condition for obtaining higher transformation rate consisted of the use of fresh explants to which 100 μM acetosyringone was added for a co-culture time of 10 min, the OD value of Agrobacterium liquid is 0.5 at 600 nm. These data provide an important basis for the application of other trait gene in the improvement of jute fiber quality.     

YG1908型真空回潮机的改造

YG190 8型真空回潮机由于增湿汽水雾化系统雾化效果较差 ,PLC电气自动控制系统不能满足不同类别烟叶的工艺要求 ,从而造成烟包回透率较低 ,烟叶含水率偏差较大。通过对增湿汽水雾化系统和PLC控制系统的改造 ,显著改善了雾化效果 ,并满足了不同类别烟叶对回潮的要求 ,烟叶回透率由97%提高到 99.5 % ,回潮后烟叶含水率的差异由原来的 3.2 6 %减少到 1.4 3%。     

Study on Flax Genetic Transformation Mediated by Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Flax is an important natural material for the linen spinning industry and as an oil crop in China. Flax products worth US $100 million are exported every year. Recently, with the development of a market economy and China's entry into the WTO, farmers and flax factories have shown a need for new varieties that have a short vegetation period, are resistant to herbicides and lodging, and have a high fiber content. In order to resolve these problems quickly, we have studied flax genetic transformation since 1998.

The paper is about flax genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. The explants were hypocotyl segments from 5-7 day old seedlings. The segments cannot form a callus when the concentration of kanamycin is 30 mg/L and 50 mg/L. Therefore, 50 mg/L of kanamycin was selected as an efficient concentration to select the transgenic plants. The segments of hypocotyl were treated with EHA105 and then were inoculated in different media (Ms, B5, N6). The experiment showed that Ms is a preference medium for flax genetic transformation. Agrobacteriumtieated segments of hypocotyl were cultured on the surface of modified Ms medium (Ms agar medium supplemented with 3.5 mg/L IAA, 2 mg/L KT, 150 mg/L LH). Callus was formed by 71.4%-81.6% of the hypocotyls. Callus inoculated in a regenerative medium of Ms with little BA and NAA could regenerate at the rate of 31.8%-40.2%, and 87.4% of regenerative plants could root in the medium of 1/2 Ms supplemented with 0.001 mg/L NAA. This transformation system has been tested by the GUS-INT gene. After co-cultivation of the segments of hypocotyl and GUS-INT, the segments of hypocotyl were moved to callus medium. After 3 days, the transformation rate of new callus was 72.0%; after 4 weeks the transformation rate of callus was 24.0%; the transformation rate of regenerative plants was 7.5%. The experiment allowed for the establishing of a flax genetic transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens.     

花粉管通道法及其在烟草育种中的应用综述

对远缘杂交的主要方法 :常规有性杂交、体细胞杂交、离体受精、花粉管通道、基因转导进行了比较 ,并探讨了花粉管通道法在烟草育种中的应用前景     

福建烟区土壤养分丰缺状况及施肥对策

分析了福建烟区 4 0 8个土壤样品的养分 ,结果表明 ,该区植烟土壤平均pH5 .2 9,有机质 2 9.70g/kg ,全氮 1.6 2g/kg ,碱解氮 15 6 .97mg/kg ,速效磷 2 8.6 1mg/kg ,交换性钾 4 4.5 8mg/kg ,交换性钙 380 .6 5mg/kg ,交换性镁 39.13mg/kg ,有效铜 4 .2 2mg/kg ,有效锌 3.5 6mg/kg ,水溶性硼 0 .0 8mg/kg ,活性锰 31.38mg/kg。对烤烟生产来说 ,福建烟区土壤的pH值偏低 ,其钾、镁、硼的供应明显不足 ,为此提出了控氮、降磷、增钾镁、喷施微肥等相应的施肥建议。     

云南烤烟中半挥发性碱性成分的分析

本文采用水蒸汽蒸馏、溶剂萃取分离的前处理方法,以及配备氮－磷检测器的气相色谱和气相色谱－质谱联用分析鉴定技术,对云南中二烤烟中半挥发性碱性成分进行了分析研究,共鉴定出３６种半挥发性碱性成分。采用内标法定量测定了吡啶、２－甲基吡嗪、２,６－二甲基吡嗪、２,３－二甲基吡嗪、２,３,５－三甲基吡嗪、２－乙酰吡啶、３－乙酰吡啶、四甲基吡嗪、吲哚和２,３－二联吡啶等１０种碱性香味成分的含量。研究结果表明：该方法重复性好,回收率较高,操作简便,是分析烤烟中半挥发性碱性成分的一种可行方法。