急非淋M2型白血病单克隆抗体与高三尖杉酯碱偶合物的制备…

用羟基磷灰石，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ－３００纯化了抗急非淋Ｍ２型白血病ＭｃＡｂ１Ｄ１，纯度为９９．９％，用直接交联方法将ＭｃＡｂ１Ｄ１与ＨＨＴ偶联，克分子比１：４０。该偶合物保持了抗体和药物活性，对急非淋Ｍ２型白血病靶细胞有选择性杀伤作用，而对急非淋Ｍ１型白血病细胞的Ｈｅｌａ细胞无明显杀伤作用。     

急非淋M_2型白血病单克隆抗体与高三尖杉酯碱偶合物的制备及体外对白血病细胞的杀伤作用

用羟基磷灰石、DEAE－Sephacel和SephacrylS－300纯化了抗急非淋M2型白血病MCAb1D1，纯度为99．9％。用直接交联方法将McAb1D1与HHT仍联，克分子比1：40。该偶合物保持了抗体和药物活性，对急非淋M2型白血病靶细胞有选择性杀伤作用，而对急非淋M1型白血病细胞和Hela细胞无明显杀伤作用。     

MTX-抗体偶联物对单核-巨噬细胞的封闭和杀伤作用

目的　观察静脉注射用免疫球蛋白与免疫抑制剂偶联物对单核—巨噬细胞的杀伤作用 ,为其临床治疗ITP奠定实验基础。方法　分别用间接和直接交联法将IVIG与MTX制备成偶联物 ,用间接免疫荧光法检测偶联物Fc段结合活性 ,以Fc受体阳性的小鼠巨噬细胞和人单核细胞白血病细胞株U937为靶细胞 ,用MTT法测定偶联物的杀伤活性。结果　偶联物对巨噬细胞的杀伤作用明显大于游离MTX ;偶联物对Fc受体阳性细胞的杀伤作用明显大于Fc受体阴性细胞。间接偶联物IVIG HSA MTX杀伤作用明显高于直接偶联物IVIG MTX。结论　MTX抗体偶联物在体外对单核—巨噬细胞显示了相对特异的杀伤活性     

抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对人自然杀伤细胞肿瘤杀伤活性的抑制作用

目的探讨抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对体外扩增的人自然杀伤(Natural killer,NK)细胞的肿瘤杀伤活性的影响。方法体外活化人外周血单个核细胞来源的NK细胞,并检测其表面黏附分子DNAM-1和LFA-1的表达水平;通过Trans-well阻隔试验,阻断NK细胞与靶细胞接触,考察细胞-细胞直接接触对NK细胞杀伤活性的影响;通过NK细胞毒性试验,引入抗DNAM-1单克隆抗体和抗LFA-1单克隆抗体,阻断相应信号途径,考察相关黏附分子在NK细胞肿瘤杀伤过程中的作用。结果体外活化的NK细胞高表达表面黏附分子DNAM-1和LFA-1。阻断NK细胞与靶细胞接触,NK细胞的肿瘤杀伤效应大大降低。应用单克隆抗体阻断DNAM-1或LFA-1信号途径,可显著降低NK细胞肿瘤的杀伤效应;联合阻断DNAM-1和LFA-1信号途径,可进一步降低NK的细胞杀伤效应。结论细胞-细胞间直接接触是NK细胞发挥肿瘤杀伤效应的重要机制,表面黏附分子DNAM-1和LFA-1介导的信号途径对维持NK细胞肿瘤杀伤活性具有重要意义。     

万源粗榧中高三尖杉酯碱的含量测定

建立了高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱含量的方法。采用超声波辅助提取高三尖杉酯碱,利用C18色谱柱,以甲醇∶醋酸铵(53∶47,V/V)为流动相,用二极管阵列检测器(检测波长290 nm)对高三尖杉酯碱进行测定,流速1.0 m L/min,柱温25℃。结果表明,在0.12~1.2 mg/m L的范围内呈良好的线性关系,相关系数R=0.999 94,回收率为97.02%~99.74%。方法操作简便、快速、灵敏度较高,适用于高三尖杉酯碱的测定。     

万源粗榧中高三尖杉酯碱的含量测定

建立了高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱含量的方法。采用超声波辅助提取高三尖杉酯碱,利用C18色谱柱,以甲醇∶醋酸铵(53∶47,V/V)为流动相,用二极管阵列检测器(检测波长290 nm)对高三尖杉酯碱进行测定,流速1.0 m L/min,柱温25℃。结果表明,在0.12¹.2 mg/m L的范围内呈良好的线性关系,相关系数R=0.999 94,回收率为97.02%1.2 mg/m L的范围内呈良好的线性关系,相关系数R=0.999 94,回收率为97.02%⁹9.74%。方法操作简便、快速、灵敏度较高,适用于高三尖杉酯碱的测定。     

吡虫啉防治褐稻虱应用技术及其对天敌的影响研究

在三代褐稻虱低龄若虫高峰期，亩用吡虫啉１６克，对水６０公斤常规喷雾，药后２天的防效为８０．８％，比噻嗪酮高２９．０％，持效期长达３０天以上。吡虫吡对稻田蜘蛛的杀伤率为２７．９％，与噻嗪酮相似；对黑肩绿盲蝽的杀伤率为８５．９％，比噻嗪酮高２７．２％，仅次于甲胺磷、毒死蜱、喹硫磷的杀伤率１００％。     

抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体定点偶联药物的制备及其抗肿瘤活性评价

目的 通过杂交瘤技术获得抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)单克隆抗体,并制备抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC),评价ADC的抗肿瘤活性。方法 采用免疫雄性BALB/c小鼠的方式获得高亲和力抗GPC3单克隆抗体,采用ELISA、流式细胞术检测抗体对抗原的亲和力及在肿瘤细胞的内吞率;并通过定点偶联技术获得DAR(drug-to-antibody ratio)为2的ADC药物,细胞杀伤试验检测其对肝癌细胞HepG2和Hep3b的增殖抑制效果。结果 抗体16C8-8E6在蛋白水平有很高的亲和力,EC₅₀为2.51 ng/mL,细胞水平(高表达GPC3的稳转株4E1、Hep3b、HepG2)亲和力明显高于原研抗体GC33(t分别为14.9、13.0和12.9,P均<0.05),在高表达GPC3的稳转株4E1的荧光强度为20 542±107;内吞率优于原研抗体GC33,48 h内吞率达73.9%。16C8-8E6-ADC对肝癌细胞HepG2和Hep3b有一定的抑制增殖活性。结论 成功获得靶向GPC3的单克隆抗体,...     

Th-LAK细胞杀伤肿瘤细胞的活性及其机理的研究

在体外观察了用rIL－2激活的人胎胸腺细胞（Th－LAK细胞），对K562癌细胞（以下称靶细胞）的杀伤过程、在倒置显微镜下，可见Th－LAK细胞呈花环状围绕靶细胞，继而靶细胞内出现颗粒，后被破坏。在扫描电镜下，Th-LAK细胞和靶细胞先互相接触．然后细胞胞浆互相融合，4h时靶细胞核膜出现孔洞，微绒毛消失，靶细胞逐渐破裂死亡。在透射电镜下Th－LAK细胞和靶细胞混合培养30min后，就可见ThLAK细胞胞浆绒毛伸向靶细胞，互相融合，染色体浓缩，溶酶体可见，细胞膜不完整，形成凋落小体以至碎裂死亡。部分Th-LAK细胞中发现微管泡结构。     

高三尖杉酯碱的提取分离工艺

对5个产地的三尖杉原料进行了鉴定,其中陕西商洛的高三尖杉酯碱含量最高.对其提取纯化工艺进行了研究,得到了适合工业化的工艺路线,并已在生产中得到了应用.     

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

利福霉素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备利福霉素单克隆抗体,并建立利福霉素竞争ELISA检测方法。方法通过利福霉素与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,建立利福霉素竞争ELISA检测方法。结果筛选出5株能稳定分泌抗利福霉素单抗的杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,其中2H1、5H5、3F12和2C8株的轻链是κ链,3A2株的轻链是λ链;5株单抗为同一位阻群;在碱性条件下较稳定。建立的利福霉素竞争ELISA检测法灵敏度为6ng/ml,与利福平无交叉反应,稳定性良好。结论已成功制备了利福霉素单克隆抗体,并建立了利福霉素竞争ELISA检测法。     

荧光标记CD3/CD4/CD8单克隆抗体的质量控制

目的对荧光素标记的CD3、CD4和CD8单克隆抗体进行质量控制。方法采用多参数的流式细胞分析技术,对单色、多色荧光标记抗体的偶联率及偶联效果进行分析与评价,并进行稳定性试验。结果荧光标记的单克隆抗体特异性保持完好;单色标记的抗体荧光强度均比进口对照低一个数量级;FITC-CD3/PE-CD4平均荧光强度与进口对照相差较大,FITC-CD3/PE-CD8和FITC-CD4/PE-CD8平均荧光强度与进口对照相差较小;FITC标记产物的F/P值控制在1～2之间;标记抗体于2～8℃放置18个月,稳定性良好。结论应用FITC、PE标记的CD3、CD4和CD8单克隆抗体可以采用流式细胞仪进行检测。     

载脂蛋白B_(100)杂交瘤细胞株的建立及单抗免疫学特性的研究

采用密度梯度离心法从新鲜人血浆中快速分离提取高纯度的LDL,以此免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交技术建立了11株稳定分泌抗ApoB_(100)的杂交瘤细胞株,所分泌的11种单抗除L_2/169为IgG2b外,其余均为IgG_1。腹水抗体效价为10~(-5)～10~(-8)。应用ELISA间接法证明,11种单抗均与ApoB_(100)(本研究制备及Sigma产品)产生强阳性反应,部分单抗与VLDL产生反应,而均不与其它包括脂蛋白、载脂蛋白在内的血浆蛋白产生反应。应用免疫印迹法证明,各种McAb识别的靶抗原分子量为525KD。对其中4种McAb的抗原表位特异性也进行了研究,通过相加试验及双抗体竞争试验均证实,4种单抗可分为2组,各识别不同的抗原决定簇。     

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

抗急非淋M_2和M_5型白血病单抗对骨髓粒-单核细胞集落形成(CFU-GM)的影响

为了使单抗用于骨髓净化和导向药物的研究,应用分泌抗急非淋M_2和M_5型单抗1D_1和1A_1,观察对正常骨髓粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)的影响。结果实验组与对照组比较无显著性差异,说明单抗对CFU-GM没有影响,不损伤正常骨髓造血干细胞,为M_2和M_5型单抗用于骨髓净化和导向药物的研究提供实验依据。     

流行性出血热病毒单克隆抗体的研究

应用流行性出血热病毒(EHFV)Z_(10)株制备的疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与BALB/c小白鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,获得10株能分泌ENFV特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其McAbs小鼠腹水荧光抗体滴度达1:2000～1:51200。经免疫印迹试验及ELISA夹心法证明1 0株McAbs为抗EHFV核蛋白(NP)的McAb,均不具有中和抗体活性,有低滴度的血凝抑制活性;经间接免疫荧光试验(IFAT)证明,2株为组特异性的McAb,5株为亚组特异性的McAb,3株为型特异性的McAb。实验用冻存免疫脾细胞进行杂交获得成功,为杂交瘤细胞的研究提供了经验。     

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立能稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用SARS-CoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立6株稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行全面鉴定。结果免疫双扩散证实1C6细胞株分泌的单抗为IgG2a亚类,其余5株细胞分泌的单抗为IgG1亚类;腹水效价均达到10-6以上;6株细胞分泌的单抗均不与麻疹病毒等其它5种呼吸道病毒发生交叉反应;Westernblot证实6株细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约150000的S蛋白及其相对分子质量为120000的裂解片段;相加指数证实6株细胞分泌的单抗识别相关的抗原表位;用硫氰酸铵洗脱法比较了6株细胞分泌的单抗的相对亲和力大小,依次为1A4>4F6>1C6>1B10>2H2>1F3;中和试验证实单抗4F6和1F3具有中和活性,中和效价均为1∶10;杂交瘤细胞株连续培养3个月以上及冻存半年后复苏,细胞生长良好,效价稳定。结论已获得抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

人血清载脂蛋白A-Ⅰ的分离纯化及其单克隆抗体的研制

应用密度梯度超离心结合离子交换层析分离提纯人血清载脂蛋白A－1（ApoA-I），经免疫扩散，SDS－PAGE和紫外扫描鉴定，证实其达到电泳纯．以此免疫BALB/c小鼠，应用杂交瘤技术建立了7株分泌抗人ApoA-I的杂交瘤细胞株，并对其免疫学性质进行了研究。上清效价为10－2～10－4，腹水效价为10－6～10－8．除1种MCAb为lgG2a外．其余均为IgG1。经ELISA间接法检测，证明7种McAb均只与ApoA-I发生强阳性反应．而不与人ApoA-Ⅱ、ApoB100、白蛋白、球蛋白、转铁蛋白和纤雏连接蛋白等血浆蛋白反应．免疫印迹试验证实，7种McAb在包含载脂蛋白在内的众多血浆蛋白成分中，仅持异地识别MW为28KD的ApoA-I。另外还对其中3种MCAb的相对亲和力及抗原结合位点进行了研究。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。