丙型肝炎诊断试剂的研究进展

自从1989年确认丙型肝炎后,对丙型肝炎的研究发展很快,涉及HCV的生物学、分子病毒学及分子免疫学等方面。成为病毒性肝炎的研究热点。本文综述了丙型肝炎诊断试剂的研究进展,并对利用这些方法对丙型肝炎进行研究取得的成果进行介绍。     

第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品。方法从国内13省市几十万名供血员中筛选样品,用多种试剂对收集到的2000多份血样进行复检,从中选出317份样品,用国外3种抗-HCV EIA试剂及国内4种抗-HCVEIA试剂进行检测,对可能被选入参考品的样品,再用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂,HCV RNA PCR试剂和CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证。利用HCV基因分型试剂对部分样品进行HCV基因型别检测,并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法确证。21个实验室会同标定。结果建立了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品及相应的质量标准。结论自2004年10月1日起,第5套抗-HCV国家参考品已被国家有关部门批准正式使用。     

第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品。方法从国内11省市几十万名供血员中筛选出871份样品,以多种试剂对其进行复核,对备选参比品样品再进行免疫荧光吸收法检测,并对人类免疫缺陷病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、类风湿因子及非特异性抗体进行检测。根据样品复检及确证结果,选定30份样品,分装并分发至11个实验室,进行会同标定。结果已制备出第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品,并建立了相应的质量标准。结论第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品已被国家有关部门批准正式使用。     

人狂犬病病毒抗体ELISA定量检测方法的建立

目的 建立人狂犬病病毒抗体ELISA定量检测方法,用于评价人用狂犬病疫苗的免疫效果.方法 将抗狂犬病病毒单克隆抗体(S010)包被酶标板,加入1 ∶ 100稀释的狂犬病病毒灭活全病毒孵育1 h,加入标准品与HRP标记的抗人IgG孵育1.5 h,显色并检测,建立检测狂犬病病毒抗体的ELISA方法,确定该方法空白限,并进行...     

第6套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第6套丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体诊断试剂国家参考品。方法从我国10省市血站及生物制品企业的供血员中筛选候选参考品血浆样本304份,采用国内外27种检测试剂进行HCV Ag、HCV Ab及HCV RNA检测后,应用CHIRON公司的RIBA HCV 3.0 SIA及MP公司HCV BLOT 3.0试剂进行确证检测;利用Abbott Real Time HCV GenotypeⅡ试剂,对HCV RNA阳性样本进行HCV基因型别检测,并以核苷酸序列测定方法对分型样本进行确认。通过分析上述检测数据,从中拟选出协作标定样本,邀请国内外生产或市场使用占较大份额的11个实验室参加该套参考品标定。取最低检出限参考品4份,分别于4、25和-20℃放置1、3、5、7、9和11 d,或置-70℃反复冻融1~6次,进行稳定性试验。结果选出65份样品组成第6套HCV抗体诊断试剂国家参考品,其中包括阴性参考品30份,阳性参考品30份,最低检出限参考品4份,精密性参考品1份。应用11家的16种HCV抗体试剂分别平行3次标定检测,阴、阳性参考品符合率均≥29/30;最低检出限参考品检测L1~L3均为阳性,L4为阴性;精密性参考品检测CV在1%~11%之间。不同温度保存11 d及-70℃保存反复冻融6次的检测结果均符合要求(P0.05)。结论建立了应用于血液筛查丙型肝炎病毒抗体试剂质量控制的第6套HCV抗体国家参考品。     

沙门菌PCR-ELISA检测方法的建立

目的建立沙门菌PCR-ELISA检测方法,并进行验证。方法根据沙门菌inv A基因设计PCR-ELISA引物及探针,进行PCR扩增、核酸杂交及ELISA检测,对变性反应条件、杂交探针浓度、杂交时间和温度及显色时间进行优化,确定阴性、阳性判定的阈值,并进行敏感性、特异性及重复性验证。用建立的PCR-ELISA方法检测人工染菌的22批中药丸剂及27批液体乳中的沙门菌,并与PCR及GB4789方法进行比较。结果 150 mmol/L Na OH变性液可使核酸变性最彻底,50 pmol/ml地高辛标记探针为最适浓度,50℃60 min为最佳杂交时间和温度,最佳显色时间为50 min;阴性、阳性的阈值为0.265。该方法最低检测限为0.5 pg/μl,灵敏度高;能针对性地扩增沙门菌的特异性片段,检测特异性强;检测结果的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好。人工染菌的22批中药丸剂和27批液体乳的PCR-ELISA方法检测阳性率明显高于PCR法,与GB4789方法检测阳性率基本一致。结论优化后的PCRELISA方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可快速检测食品、药品中的沙门菌。     

检测重组人血小板生成素含量的改良双抗体夹心ELISA方法的建立

目的建立检测重组人血小板生成素(rhTPO)含量的改良双抗体夹心ELISA方法。方法用棋盘滴定法确定包被单抗、一抗和酶标二抗的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Lowry法检测结果进行比较。结果包被单抗的最佳包被浓度为1.0μg/ml,一抗和酶标二抗的最佳使用浓度分别为1∶5000和1∶10000;检测的线性范围为(125～4000)pg/ml,检测限为75pg/ml,定量限为189pg/ml;不同浓度rhTPO的回收率在(97.0±2.1)%～(105.0±8.5)%之间;6批样品的试验内变异系数在3.2%～8.1%之间,试验间变异系数在5.7%～10.4%之间,特异性良好;与Lowry法检测结果具有良好的相关性。结论已建立检测rhTPO含量的改良双抗体夹心ELISA法,准确性、精密性、特异性良好,可用于rhTPO研究及生产过程中的定量分析。     

发光试剂与酶联免疫试剂检测丙型肝炎抗体的临床评价

目的对丙型肝炎抗体的酶联免疫试剂和化学发光试剂进行临床考核和比较。方法用国外进口注册的抗HCV酶联免疫试剂和化学发光试剂检测丙型肝炎试剂国家参考品和283份可疑丙肝感染者血样,对不一致样品再用HCV RI-BA和HCVRNAPCR试剂进行确证。结果两种试剂均可达到国家标准,酶联免疫试剂特异性较好,化学发光试剂灵敏度较高。结论两种试剂均可用于丙型肝炎抗体检测。     

应用ELISA检测小鼠肝炎病毒抗体

以 DBT 细胞增殖的小鼠肝炎病毒 MHV-3经差速离心浓缩后作为抗原,用辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌 A 蛋白(HRP-SPA)作为第二抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 MHV抗体。经本中心及三个外单位共检测362份普通群小鼠血清样本,MHV 抗体检出率为149/362(41.16%)屏障系统内小鼠血清样本121份,均为阴性。     

流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体间接ELISA检测方法的优化及其实验室内控品的制备

目的优化流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,并制备IgA抗体实验室内控品。方法采用ELISA检测法对流感病毒抗原(全病毒及其相应HA抗原)及包被浓度(0. 5、1、2、4μg/mL)、封闭液(1%BSA、10%FBS、5%脱脂奶粉)及封闭时间(1、1. 5、2 h)、样本稀释液(含1%BSA的PBST、含2%脱脂奶粉的PBST、样本保存液)及样本作用时间(45、60、75 min)、酶标抗体稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000)进行优化。采用优化的方法制备针对H1N1、H3N2和B型3个型别流感病毒的IgA抗体检测用实验内控品,并用该方法对接种三价流感减毒活疫苗的20名志愿者的鼻咽拭子样本进行检测。结果最适间接ELISA法检测条件为:以全病毒作为包被抗原,包被浓度为1μg/mL;以含1%牛血清白蛋白为封闭液封闭2 h;样本稀释液为2%脱脂奶粉的PBST,作用时间为60 min;酶标抗体稀释度为1∶1 000。采用优化方法制备的H1N1、H3N2、B型IgA抗体阳性实验室内控品几何平均滴度分别为23、45、35,可接受范围分别为16～32、32～64、32～64。接种疫苗后20名志愿者中3种型别IgA抗体滴度较接种前均显著增高(P 0. 001),40%～50%志愿者接种后IgA抗体滴度比接种前至少升高2倍。结论成功优化了流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,制备的IgA抗体的实验室内控品可用于流感减毒活疫苗接种后鼻咽拭子抗体的检测。     

不同单位抗—HCV诊断试剂的质量比较

为考核丙型肝炎诊断试剂的质量，在建立了第2代参考品之后，对3个单位的抗—HCV诊断试剂进行了抽检，结果3个单位产品的质量均属满意，但仍然需要进一步提高。     

人类免疫缺陷病毒抗体EIA检测试剂质控参考品的建立

以国际抗－HIV质控参考品为参比，用亚塔、阿克苏、UBI、普生、万芬等国内外试剂对41份执－HIV阳性和阴性人血浆进行筛查，并进一步以免疫印迹法确证，建立了我国第一代抗－HIV检测试剂质控参考品，其中包括阳性、阴性、灵敏度和精密性参考品。用本品对91批次国产试剂进行检测并与国外试剂进行对比，证明有较好的分辨力。在此基础上制定出我国抗－HIV检测试剂质量标准，此标准及参考品已获国家批准。     

检测HCV RNA的PCR试剂质控试行参考品的建立

选慢性丙型肝炎病人中HCVRNA含量不等的阳性血清作为阳性标准，采用选自HCV基因5’端非编码区的不同引物来扩增病毒基因，扩增产物与分子量标准进行比较，部分产物用酶切初步分析进行确证。选国家HCV抗体诊断试剂盒临床验证参考品中的阴性样品作为阴性标准，经反复检测显示HCVRNA为阴性。选强阳性血清经5%小牛血清稀释作为灵敏度标准，检测范围为10－5～10－7。应用该参考品对北医肝病研究所的三批HCVRNA诊断试剂盒进行检测，阳性和阴性标准均符合要求，灵敏度为10-5～10-6。     

HIV抗体确认试剂国家参考品的建立

目的建立评价HIV抗体确认试剂的国家参考品。方法从我国部分地区收集HIV感染者或可疑感染者以及非HIV感染者血浆样品,并对其进行HIV抗体、核酸以及抗体条带等检测,从中筛选出有代表性的样品组成参考品,用4家不同的HIV抗体确认试剂进行检测和标化。结果共筛选出27份样品组成HIV抗体确认试剂参考品,其中10份为HIV抗体确认阳性参考品,12份为HIV抗体确认阴性参考品,5份为HIV抗体不确定参考品。用4家不同的HIV抗体确认试剂标化12次,10份HIV抗体确认阳性参考品均检测为确认阳性;5份不确定参考品均检测为确认阳性或不确定,无检测为阴性者;12份阴性参考品10次均检测为确认阴性。结论该参考品可用于评价HIV抗体确证试剂的质量。     

第3代丙肝试剂国家参考品的研制及初步应用

筛选全国 14个省、市、自治区的 2 5 0 0 0多份血样 ,取其中 2 6 4份用国产 14种抗HCVEIA试剂 ,国外 2种第 3代抗HCVEIA试剂复检 ,用RIBAHCV 3.0和PCR试剂确证。经两轮会同标定 ,国外两个实验室复核 ,确定40份阳性、40份阴性样品组成第 3代丙肝试剂国家参考品。 40份阴性样品中包括国内外几十种试剂曾经出现过非特异假阳性反应的阴性样品以及其S C值较高的阴性样品。 40份阳性样品中 ,6 5 %为弱阳性样品 ,有的样品含有全谱的抗HCV抗体 ,有的样品含有某几种抗HCV抗体 ,有的样品以抗HCV某种蛋白抗体成分为主 ,还有的样品只含有某种特定的抗HCV蛋白抗体。该参考品已通过专家鉴定并经卫生部批准使用。经改进后达到第 3代参考品标准的国产试剂的临床考核说明 ,该参考品促进了国产试剂质量的提高 ,并达到国际先进水平。     

应用免疫印迹法分析丙型肝炎相关性抗体

应用两种免疫印迹法对二代ELISA测试的69份血清进行了追加试验。结果表明:8份ELISA阴性血清免疫印迹均阴性,61份ELISA阳性血清有1份免疫印迹阴性。ELISA假阳性率为1.67％。在60份免疫印迹阳性血清中,抗结构区(capsid),非结构区NS_3和NS_4抗体的阳性率分别为83％、93.3％和70％。其中丙型肝炎相关性抗体的分布,以抗capsid、NS_3、NS_4抗体都阳性为主(58.7％)。在输血后急性肝炎和肝细胞癌患者中。丙型肝炎相关性抗体的分布没有统计学上的差异。     

卵清蛋白国家定量参考品的建立

目的建立卵清蛋白国家定量参考品。方法用德国试剂盒测定不同厂家、不同级别卵清蛋白的含量,筛选与试剂盒标准卵清蛋白含量符合率最高的样品作为参考品原料,并对参考品保护剂进行验证。将参考品贮存母液系列稀释后,经3个实验室协作标定,确定其标示量。结果选取SigmaGⅡ作为参考品原料;参考品保护剂对卵清蛋白测定结果无影响,并可显著提高参考品的稳定性;经协作标定,确定浓度为15、10、5和2.5ng/ml系列参考品的标示量分别为(17.96±1.00)、(12.25±1.51)、(6.79±1.14)和(3.11±0.31)ng/ml。结论已建立了含量准确,重复性和线性较好的卵清蛋白国家定量参考品。     

重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立

目的建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测。方法以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证。用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率。结果建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,最低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2(IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应;该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95.13%～104.50%之间,试验内及试验间变异系数均<15%;包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5 d,其检测HEV抗原内部参考品的A450值及敏感性均未发生显著变化;3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95%,符合相关质控要求。结论已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测。     

一起由丙型副伤寒沙门菌引起的食物中毒检测分析

目的快速查找食物中毒原因。方法根据临床表现、流行病学调查制定实验室检测项目并作出检测。结果从剩余食物、患者肛拭及粪便中检出丙型副伤寒沙门菌。结论由实验室检测得知,该起食物中毒事件是由丙型副伤寒沙门菌引起。     

稳定表达丙型肝炎病毒HLA-A2限制性多表位基因C1R-AAD细胞克隆的建立

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性多表位基因的C1R-AAD细胞克隆。方法合成人泛素基因(Ub)和HCVHLA-A2限制性多表位基因(Mep),分别克隆入原核表达质粒pRSET-A,构建多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pRSET-Ub-Mep,得到复合多表位基因Ub-Mep,亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(-),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep,转染至C1R-AAD细胞,G418压力筛选后,通过有限稀释法获得稳定表达Ub-Mep融合蛋白的C1R-AAD细胞克隆,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中Ub-Mep基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Westernblot法检测Ub-Mep蛋白在稳定转染细胞中的表达。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep经酶切鉴定证明构建正确;在稳定转染的C1R-AAD细胞中可检测到Ub-MepmRNA和蛋白水平的表达。结论已建立了稳定表达HCVHLA-A2限制性多表位抗原的C1R-AAD细胞克隆,为进一步研究HLA-A2限制性多表位基因诱导的细胞免疫应答建立了靶细胞。