应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

应用EHF cDNA探针检测人用鼠源性杂交瘤细胞和单抗制剂

从R3 克隆中提取并纯化流行性出血热R2 2 株M片段cDNA ,用光敏生物素标记而制备出生物素化的cDNA探针。用此探针与R2 2 株、76 118株及R3 克隆进行斑点杂交 ,均出现阳性杂交信号 ,而与仙台病毒、鼠肺炎病毒及BALB/c小鼠肝细胞、Vero E6细胞和SP2 / 0细胞杂交均为阴性。探针的灵敏度为 2 5pg目的核酸。用此探针测定了来自 9个单位 12株人用鼠源性杂交瘤细胞和 7个单抗制剂均为阴性。该结果与血清学检验结果一致     

应用地高辛标记HCMV DNA混合探针检测人巨细胞病毒DNA

本文比较了~(32)P和地高辛标记的HCMV EcoRI单一Z片段与EcoR IZ、K、J混合片段探针的敏感性。结果~(32)P和地高辛分别标记的EcoRIZ单一片段检测敏感性分别为50pg和1pg,而两者标记的EcoRI Z、K、J混合片段检测敏感性分别提高到5pg和0.1pg。地高辛标记的混合片段探针比~(32)P标记单一EcoRIZ片段探针敏感性提高500倍,比~(32)P标记混合探针高50倍,比地高辛标记的EcoRI Z片段探针高10倍。应用地高辛标记混合片段探针检测了正常小儿尿标本10份,阳性率为60％(6/10),与免疫组化方法对比,两者符合率为100％。检测肾移植患者尿标本33份,阳性率为46％(15/33);白血病患者尿标本18份,阳性率为72％(13/18),与PCR方法对比两者符合率为93％。地高辛标记混合探针可快速、敏感、特异地检测人巨细胞病毒感染。     

应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。     

地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA试验条件的改进

<正>目前,应用地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA含量仍是最常用的检测方法,该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点。在实际操作中,地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响。为此,我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索。     

抗急性非淋巴细胞白血病M_5型单克隆抗体研究

用急性非淋巴细胞白血病(急非淋)M_5型白血病相关抗原免疫 BALB/C 小鼠,取免疫鼠脾细胞与 NS-1骨髓瘤细胞融合,建立了2株能稳定分泌抗急非淋 M_5型白血病抗体的杂交瘤株。所分泌的单克隆抗体与急非淋 M_5型白血病有反应,与其他型白血病没有交叉反应,具有很好的特异性。CFU-GM 培养结果对骨髓造血干细胞没有影响。     

应用转瓶大规模培养杂交瘤细胞生产ABO血型单克隆抗体的工艺

目的建立用转瓶悬浮培养杂交瘤细胞生产ＡＢＯ血型抗原单抗的工艺。方法 在无ＣＯ２条件下, 应从转瓶培养分泌抗人Ａ和Ｂ血型抗原单抗的杂交瘤细胞。结果在适当的ｐＨ、转速和起始密度的条件下,细胞 的生长密度和单抗效价均超过静态培养水平。结论该工艺投资少,操作简便,运行稳定,适于规模化生产。     

应用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞生产体内治疗用WuT3单克隆抗体

用3．5L和14L生物反应器培养WUT3杂交瘤细胞,结果表明用人血清可以代替牛血清培养WuT3细胞,在1％人血清培养液中添加适当营养成分,可达到10％小牛血清浓度下的细胞浓度（1．5×106／ml）和单抗产量（大于50μg／ml）。放大到75L生物反应器中采用半连续方式培养,建立了中试培养工艺流程和质控点,收获时细胞浓度为1.0×106～1．5×106／ml,单抗产量为40～70μg／ml,平均日产单抗达1g。在3．5L、14L、75L逐级放大培养过程中,细胞支原体为阴性,收获上清中单抗免疫活性合格,热原试验合格。     

人巨细胞病毒基因克隆及分子探针的临床应用

以 PuC18为载体克隆了人巨细胞病毒(HCMV)AD169株 ECoRI 部分基因组片段。以α~(-32)P 标记的 ECoRI-Z 片段为探针,对尿、脐带血和宫颈分泌物等标本进行了 HCMV DNA 的临床诊断分析。该探针可以检测出12pg 水平的 HCMV DNA,但与人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVI)和人单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)、λ噬菌体、Puc18载体 DNA 等不杂交。以斑点杂交法检测了正常新生儿尿标本50份和临床诊断为新生儿黄疸的尿标本109份,其阳性率分别为8%和36%;此外还检测了172份随机收集的新生儿脐带血白细胞 DNA,其阳性率为15%,说明了我国新生儿 HCMV 感染的严重性。检测结果亦证实患宫颈炎和宫颈癌的患者,HCMV DNA 检出率明显高于正常妇女,说明分子杂交法可用于各种临床标本 HCMV DNA 的检测。     

应用篮式生物反应器培养1A_5杂交瘤细胞及单克隆抗体分泌

目的 为了提高体外培养的杂交瘤细胞单克隆抗体的合成分泌,并为治疗型人源化单克隆抗体生 产摸索条件。方法 应用５Ｌ篮式及非篮式生物反应器培养１Ａ５杂交瘤细胞,以分泌干扰素单克隆抗体,从中对 １Ａ５细胞的接种浓度、反应动态、培养方式等进行研究。结果 细胞最适的接种浓度为２．０×１０５／ｍｌ左右;同非篮式 培养相比,在篮式培养过程中,通过葡萄糖消耗率的监测,及时地调节培养条件及换液时间,延长了培养周期,增加 了每罐收液批次,并且每次是全量换液,最高收液效价为１：４０９６。结论（１）１Ａ５ 细胞分泌干扰素单抗属于负生长 耦连型,葡萄糖消耗率与细胞的生长呈线性关系,可以利用糖消耗率的变化判断篮式生物反应器中细胞生长状况; （２）篮式生物反应器载体培养优于非篮式生物反应器悬浮培养;（３）适当地增加培养基中葡萄糖的量,可以提高干 扰素单抗的合成分泌。     

杂交瘤细胞流加培养中葡萄糖和谷氨酰胺的代谢控制

对底物限制的流加培养中杂交瘤细胞HB 58的生长、代谢和单抗生成进行了研究。葡萄糖或 谷氨酰胺限制引起比生长速率下降。葡萄糖限制时,乳酸生成减少,细胞对葡萄糖的得率增 加,乳酸对葡萄糖的得率降低,说明葡萄糖更多地参与三羧酸循环。谷氨酰胺限制时,氨和丙氨酸生成减少,细胞和氨对谷氨酰胺的得率增加,丙氨酸对谷氨酰胺的得率减小,说明谷氨酰胺更多地参与脱氢反应,其有效利用率得到提高。     

小鼠微小病毒Q-PCR检测方法在病毒去除工艺验证中的应用

目的将小鼠微小病毒(murine minute virus,MVM)Q-PCR检测方法应用于病毒去除工艺验证中。方法使用MVM Q-PCR法和细胞病变法同时检测10倍系列稀释后的MVM,建立核酸拷贝数与病毒滴度之间的函数关系,并应用于纳米膜过滤和层析病毒去除工艺验证中。结果核酸拷贝数与病毒滴度间呈线性关系,R²可达0. 986 3。应用于纳米膜过滤去除工艺验证,两种方法检测结果具有一致性;应用于层析去除工艺验证,两种方法在亲和层析、阴离子柱层析、阴离子Q膜层析工艺中结果具有一致性,但在具有灭活病毒的疏水层析中,结果不一致。结论在病毒去除工艺验证中,MVM Q-PCR法可作为现有细胞病变法的补充。     

胶体金探针的研制及在T细胞亚群检测中的应用

采用鞣酸—柠檬酸钠还原法制备了不同颗粒大小（如φ6nm、φ10nm、φ15nm）、不同种类的胶体金标记抗小鼠IgG、抗人IgG及SPA等探针。所制备的胶体企探针直径达到标记要求，颗粒大小均匀，稳定性好。用该探针检测健康人外周血淋巴细胞表面抗原，如CD3、CD4和CD8等T-淋巴细胞亚类抗原，其本底低，对比度好，阴阳性分明，优于常规的免疫荧光法。     

应用生物素探针检测重组人α_1型干扰素中外源DNA

本文应用生物素标记重组人α_1 型干扰素(rHuIFN-α_1)工程菌的总DNA作为探针,检测rHuIFN-α_1制品中的外源DNA,其灵敏度可达10pg。用蛋白酶K(Proteinase K)消化制品中的蛋白,排除了使用生物素所常见的非特异性影响。     

在无血清培养基中代谢副产物对杂交瘤细胞生长代谢的影响:Ⅱ.氨的作用

目的 在无血清培养基中，研究氨对杂交瘤细胞生长代谢的影响。方法 在培养基中添加不同浓度的氨，考察细胞生长和代谢及单抗生成的变化。结果 添加0．8mmol/L）的氨时就对细胞生长和代谢有影响，当氨浓度达4mmol/L时，对细胞的生长代谢有明显的抑制，当培养基中氨浓度高于6mmol/L时，细胞生长停止，代谢受到严重影响。氨的添加降低了培养上清中的单抗浓度，但提高了单抗的比生产速率。结论 氨对细胞生长和代谢有较大的影响，对单抗浓度的影响主要由细胞密度降低造成，单抗的比生产速率增加。     

用光敏生物素标记的探针检测人用鼠源单抗中残余DNA

将培养至对数期的Ag8．653小鼠骨髓癌细胞经裂解、抽提、RnaseA处理和纯化，获得A260nm／A28nm，为2.013、电泳为一条区带的纯化的小鼠骨髓瘤细胞全DNA；该DNA经不同处理，标记两个探针，即全DNA通过缺口转移法，用‘中标记和全DNA用光敏生物素（军事医学科学院二所提供）标记。在比较灵敏度时，将纯化的未标记的小鼠骨髓癌细胞全DNA分别点在两张硝酸纤维膜上（每张膜上分别含20Pg、10pg和5pg），再用’于和光敏生物素标记的探针分别与这两张膜进行斑点杂交。在用光敏生物素标记的探针检测单抗样品时，随机取3批单克隆抗体（分别经…     

一种检测环境样品和细胞中肼的香豆素类比率型荧光探针

以香豆素为荧光团,4-溴丁酰基为识别基团,设计合成了一种比率型肼荧光探针COCB。其结构通过1HNMR、13CNMR和HRMS确证。肼对探针COCB中溴代丁酰基的选择性脱保护使分子内电荷转移(ICT)过程恢复；COCB在 420 nm 处蓝色荧光衰减,而在 480 nm 处青色荧光增强,实现了对肼的比率检测。COCB对肼表现出高选择性、高灵敏度和强抗干扰能力,并能在较宽的线性范围(0~250 μmol/L)和pH范围(6~11)内检测肼,检出限低至0.15μmol/L。此外,COCB合成简便,细胞毒性较低,已成功用于实际水样、土壤以及活细胞中肼的检测。     

水性CdTe量子点在肝癌细胞标记中的应用

采用一种简单的合成方法,用空气中稳定性良好的亚碲酸钠为前体,合成了高质量的CdTe量子点,发射范围从520～620 nm可调,最佳实验条件下发光效率达40%以上。用叶酸修饰的CdTe量子点作为荧光探针,成功标记肝癌细胞,实验结果表明,通过叶酸偶联的CdTe量子点,能有效进入肿瘤细胞内部。     

细胞荧光转化灶法检测狂犬病病毒滴度

目的应用细胞荧光转化灶(fluorescence focus units assay,FFU)法检测狂犬病病毒滴度。方法将狂犬病病毒稀释后接种BSR细胞,培养22~24 h,用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,计数病毒感染细胞的荧光灶数,计算病毒滴度。采用乳鼠半数致死量(median lethal dose,LD50)法和建立的方法分别测定14批狂犬病病毒滴度,分析两者间的相关性;取同一份病毒液,于不同时间点检测3次,每个时间点重复检测6次,验证方法的重复性;取3份滴度不同的病毒液,由2个操作者在不同时间重复测定3次,验证方法的中间精密性;将同一份病毒液按2倍梯度稀释,共9个稀释度,分别检测病毒滴度,重复测定3次,确定该方法的线性范围。应用建立的方法检测38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度。结果乳鼠LD50法测定14批狂犬病病毒的-Lg LD50值范围为4.20~8.19,FFU法Lg FFU值范围为3.76~7.69,两种方法检测结果趋势相同,线性回归相关系数R-Sq(调整)=96.1%,存在良好的正相关性;同一个时间点检测6次及不同时间点检测3次的CV值均小于2.00%;两个操作者在不同时间重复测定3次的CV值均小于8.00%,两个操作者之间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05);样品浓度与Lg FFU呈良好的线性关系,R-Sq(调整)=99.3%,线性范围为2.26~6.12。38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度平均Lg FFU在3.63~7.69之间,SD值在0.021~0.57之间,CV值小于10.00%。结论建立的细胞FFU法准确性、重复性、中间精密度好,该方法可用于检测狂犬病病毒滴度。