线粒体能量代谢相关miRNA的研究进展

线粒体为真核细胞的能量工厂,其能量代谢与细胞凋亡、自噬和衰老等过程密切相关,在疾病的发生发展以及后续治疗中也发挥着重要作用。microRNAs(miRNAs)为一类广泛存在于真核生物中的单链RNA,可通过降解靶基因或抑制靶基因的翻译来调节蛋白表达。近年来多项研究表明,miRNA还可通过调节线粒体相关基因的表达,调控线粒体的结构及功能,影响线粒体的能量代谢。本文就miRNA的作用机制及其与线粒体能量代谢关系的研究进展作一综述。     

奶牛microRNA-205靶基因及调控网络的精细预测分析

目的预测奶牛microRNA-205(bta-miR-205)候选靶基因,对其进行生物信息学精细分析,构建候选靶基因参与的调控网络。方法应用miRBASE、Targetscan和miRWalk软件预测其候选靶基因,经Gene Ontology、Panther、STRING和DAVID软件进行功能注释、分类统计、蛋白质互作及KEGG通路注释和富集分析,通过Cytoscape软件绘制靶基因可能重点参与的调控网络。结果 miR-205基因成熟区序列高度保守,共筛选出288个bta-miR-205候选靶基因,其参与的主要生物进程是细胞过程、代谢过程和生物调控,主要参与形成细胞器等细胞组分,主要分子功能是结合、催化作用。MAPK3等多个候选靶基因存在基因共表达和蛋白互作关系,参与免疫系统、适应性免疫系统、基因表达(转录)、抗原加工等反应途径显著富集在鞘脂、甲状腺激素、PI3K-Akt等信号通路。结论 bta-miR-205的候选靶基因MAPK3等可能通过参与免疫系统、基因表达(转录)、抗原加工等反应途径及鞘脂、甲状腺激素、PI3K-Akt等信号通路,在奶牛炎症疾病抗性、生殖及发育过程调控中发挥重要作用。     

RECK基因3′UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的构建RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs)基因mRNA 3′非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,以进一步研究microRNA对RECK基因的调控。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7基因组DNA为模板,PCR扩增RECK基因mRNA的3′UTR全长及两个截短片段,利用双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR、双酶切、测序鉴定重组子,双荧光报告基因检测其表达活性。结果重组载体中RECK3′UTR序列与GenBank序列比对一致且插入方向正确;3个重组载体分别命名为pGL3-RECK 3′UTR-1、pGL3-RECK3′UTR-2和pGL3-RECK 3′UTR-3,转染细胞后可表达荧光素酶基因。结论成功构建了RECK基因3′UTR全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,为进一步研究microRNA对靶基因RECK的调控奠定了基础。     

miR-451靶向调控肾小球系膜细胞Ywhaz基因的表达

目的探讨miR-451对肾小球系膜细胞Ywhaz基因表达的靶向调控。方法应用生物信息学技术对miR-451的靶基因进行预测,PCR法扩增靶基因3′UTR全长片段,插入荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORTTMvector中,构建荧光素酶报告质粒pmiR-Ywhaz-3′UTR。将miR-451 mimics和NC mimics分别转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,将miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,采用Real-time RT-PCR和Westernblot法检测miR-451和Ywhaz的表达水平;将miR-451 mimics和NC mimics分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,检测各组细胞荧光素酶活性。结果 Ywhaz基因3′UTR区有11个碱基与miR-451种子序列匹配,其中7个碱基呈高度保守性;荧光素酶报告质粒经测序鉴定构建正确;miR-451在miR-451 mimics组呈高表达,在miR-451 inhibitor组表达降低;miR-451可抑制Ywhaz的蛋白表达;荧光素酶活性检测发现,miR-451可通过与Ywhaz3′UTR的结合,抑制Ywhaz的表达。结论 miR-451可直接靶向糖尿病相关基因Ywhaz,抑制其蛋白表达,为进一步研究miR-451调控早期糖尿病肾病发生发展的机制提供了依据。     

奶牛miR-124a靶基因预测及生物信息学分析

目的预测奶牛miR-124a(bta-miR-124a)的靶基因,并对其生物学功能、调控机制以及参与的信号转导通路进行富集分析,为bta-miR-124a调控乳品质代谢的功能验证研究提供理论依据。方法利用miRBase、miRWalk和Targetscan等在线数据分析系统,获得bta-miR-124a的前体及成熟区序列,同时预测其候选靶基因并取交集,进而对筛选获得的候选靶基因进行GO功能注释及信号通路富集分析。结果 bta-miR-124a序列在各物种间高度保守,其候选靶基因主要富集在生物调控、细胞生长、代谢等生物学过程中。KEGG信号通路显示,在癌症、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein,AMPK)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)信号转导、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成等信号通路中,候选靶基因均被富集。结论 bta-miR-124a的候选靶基因在癌症发生、AMPK信号转导、脂肪酸代谢中发挥重要作用。其中,脂肪酸代谢是bta-miR-124a可能参与的主要代谢调控通路。为后期bta-miR-124a在奶牛乳腺组织中调控乳脂代谢的功能机制的研究提供参考。     

靶向果蝇Kr-h1基因的mi RNA预测及其生物信息学分析

目的预测靶向果蝇Kr-h1(Krǜppel homolog1)基因的miRNA,并对其生物学功能及相关生物信息学进行分析,为进一步研究miRNA通过调控Kr-h1的表达而参与保幼激素(juvenile hormone,JH)对果蝇变态发育的调控奠定基础。方法通过microT-CDS、Targetscan和miRanda在线预测网站,对靶向Kr-h1基因的miRNA进行预测,对预测得到的多个miRNA按靶向结合可能性的大小进行汇总,3个网站均能预测到的miRNA为交集miRNA,对交集miRNA的靶基因及Kr-h1基因进行生物信息学功能分析。结果 microT-CDS、Targetscan和miRanda分别预测到30、7和11个靶向Kr-h1的miRNA,其中交集miRNA有4个,为miR-8、miR-277、miR-927和miR-964。功能分析发现,交集miRNA的靶基因主要参与细胞过程、生物过程和代谢过程,Kr-h1基因主要与昆虫生长发育及生殖相关。结论潜在靶向Kr-h1的miRNA涉及多个生物学过程,与昆虫的生长发育密切相关。     

miRNA在几种动物应激中的研究进展

miRNA是一类内源性18～22个核苷酸的非编码小RNA分子,通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′untran-slated region,UTR)结合来调节基因的表达。在动物的多种生理进程和疾病的发生发展中,miRNA均发挥着重要作用。应激是机体对外界环境变化而产生的一系列非特异性的应答反应,不同应激源的刺激会导致miRNA的表达发生改变。因此,探究miRNA在动物应激中的研究进展对畜牧业的发展具有重要意义。本文综述了应激相关miRNA的研究进展,以期从分子水平寻找预防和诊断动物应激的方案。     

血源乙肝疫苗与基因工程乙肝疫苗联合免疫的效果观察

应用血源乙肝疫苗和基因工程乙肝疫苗,对婴幼儿和小学生按0、1、6免疫程序进行联合免疫的效果观察。结果第1、2针用血源苗,第3外用基因苗免疫的阳转率（82．9％）明显低于3针均用血源苗的阳转率;第1、2针用血源苗,第3针用基因苗与3针均用基因苗免疫的阳转率均达100％;用血源苗基础免疫,5年后用基因苗加强免疫的阳转率（98．2％）与用血源苗加强免疫的阳转率（100％）差异无显著意义,但加强免疫后的GMT值,基因苗（515．2）明显高于血源苗（31．6）。表明基因苗同样具有良好的免疫效果。     

狂犬病病毒PV-2061株基因序列测定及其抗原性和免疫原性分析

目的测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)PV-2061株全基因组序列,并分析其抗原性及免疫原性。方法 RTPCR法对RV PV-2061株基因组进行分段扩增,分别克隆至p MD18-T Simple Vector,转化感受态E.coli TOP10,挑取阳性克隆,进行测序。应用DNAstar Meg Align软件对测序结果进行拼接和分析;ELISA法检测PV-2061株的抗原性;用主种子批毒种制备的原疫苗免疫小属,检测PV-2061株的免疫原性。结果 RV PV-2061株的基因组全长11 932 bp,由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G、L 5个结构基因,每个基因由3′端到5′端的非编码区及中间的编码区构成。与Gen Bank中已知全基因组序列的毒株比较,基因组前端3′先导序列和N基因的非编码区均无长度变化,从P基因开始,基因非编码区的长度开始出现差异,导致各毒株基因组长度不同。RV PV-2061株的抗原值为7.46 IU/ml;主种子批毒种制备原疫苗保护指数为1 585。结论确定RV PV-2061株全基因组序列为基因1型,且具有RV特有的抗原性和良好的免疫原性,为狂犬病疫苗的设计和毒株的筛选提供了实验依据。     

非编码RNA在癌症中的功能研究

人类基因组约含有超30亿个DNA碱基对,其中约含有2-2.5万个蛋白质编码基因,这些蛋白质编码基因只占据不到2%的基因组序列,剩余的近99%的DNA都位于非编码区。基因组中大量的非编码区域曾被认为基因组中的"暗物质",普遍认为其没有任何实际的功能。但是随着基因测序技术的发展,越来越多的"垃圾"DNA被证实并不"垃圾"。科学家们发现,这些非编码基因虽然不表达蛋白质,但是会生成非编码RNA,并且越来越多的证据表明非编码RNA具有重要的生物学功能,在真核生物的基因表达调控过程中发挥重要的核心作用,这些非编码RNA可作为基因调控网络中的主要参与者促进基因的转录调控,与各种人类疾病的机制密切相关。本文综述了非编码RNA的定义、性质特点、原理及其在癌症中的功能。     

microRNA及其靶基因多态与肿瘤易感性

microRNA及其靶基因的单核苷酸多态性（SNP）影响microRNA与靶mRNA的结合和对靶基因表达的调控,使个体对多种疾病的易感性、治疗及预后存在差异.文章介绍了microRNA形成以及作用机制、microRNA及其靶基因SNP对肿瘤易感性的研究进展.     

microRNA与糖尿病患者下肢动脉硬化的相关性

临床中发现,越来越多的糖尿病患者并发下肢动脉硬化,临床表现特点有间隙性跛行、休息痛、缺血性坏疽。迄今动脉硬化具体的发病机制尚未阐明,目前较为普遍认同"损伤应激学说"对其发病机制的表述,但未涉及基因调控。由于发病机制在基因调控领域中的空白,不能确定相关基因的干预靶点,影响了对糖尿病下肢动脉硬化的有效预防和治疗。最近10年,microRNA成为基因研究领域中的热点,预计约30%的人类基因均会受microRNA调控,1个microRNA家族可能与多达200个靶基因结合,相比大量的靶基因,起调控作用的microRNA数量要少得多,因此通过microRNA研究糖尿病下肢动脉硬化的发病机制更易进行,同时这也是利用microRNA研究基因表达调控的巨大优势。本文对microRNA的热点及其与糖尿病患者下肢动脉硬化的相关性作一综述。     

per1,per2 3′UTR双荧光素酶报告基因重组质粒的构建

构建了包含目的片段小鼠节律基因per1,per2 3′UTR全长的重组质粒,为初步分析转录后可能调控per1,per2基因的miRNAs提供了有效手段。用反转录试剂盒将从小鼠肝脏组织提取的RNA反转录得到cDNA,以获得的cDNA为模板PCR扩增per1,per2 3′UTR全长,经回收纯化、酶切后将目的片段定向克隆到PGL3-promoter质粒上,再经转化扩增挑取克隆进行菌落PCR,对获得的阳性克隆进行酶切鉴定并测序。PCR产物鉴定结果表明,目的片段per1,per2 3′UTR序列扩增成功;菌落PCR及单酶切鉴定结果表明,per1,per2 3′UTR已插入PGL3-promoter载体中;测序结果表明,per1,per2 3′UTR插入序列,插入方向正确。per1,per2 3′UTR双荧光素酶报告基因重组质粒的成功构建为进一步研究节律基因转录后的调控机制奠定了基础。     

CircRNA在自身免疫疾病中的研究进展

Circular RNA(简称CircRNA)为一类新发现、长链非编码的内源性环状RNA分子,能够参与基因组转录及转录后水平的调节,竞争内源性RNA特异性结合miRNA,进而通过调控其活性影响下游靶基因的表达,参与发育、凋亡,影响诸多疾病的进程。最新的研究证实,CircRNA调控了类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)等自身免疫性疾病的发生,有望作为此类疾病诊断标志物或治疗靶标。本文就CircRNA的生物学特性及其在自身免疫性疾病中的研究状况作一综述。     

miRNA对尤因肉瘤作用机制的研究进展

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码的小分子RNA,其通过与靶mRNA的结合,降解或抑制其翻译,在转录后水平参与基因的调控,从而控制细胞的增殖、分化、凋亡等,参与疾病的发生及发展。尤因肉瘤(Ewing sarcoma,EWS)是原发性骨肿瘤中发病率仅次于骨肉瘤的骨恶性肿瘤,青少年多发,恶性程度高,复发及远处转移是导致患者死亡的主要原因。miRNA可通过基因水平的调控,参与EWS的发生发展、侵袭、转移等重要生物学过程,与患者的预后密切相关。本文就miRNA参与EWS相关的分子机制作一综述,以期为后期研究及临床治疗EWS提供依据。     

热休克蛋白60的研究前景

简要介绍了热休克蛋白60(HSP60)及其在细胞中的调控功能。叙述了HSP60与某些疾病的关联和在免疫中的作用。最后,对HSP60的研究前景进行了展望。     

冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化及其功能的预测分析

目的探讨冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化,并对其功能进行预测分析。方法将大鼠置(4±0. 05)℃冷暴露12 h,同时设对照组(24℃常温饲养),qRT-PCR法检测miR-383-5p在血清和肝脏中的表达水平。应用miRanda、TargetScan和miRDB 3种软件同时对miR-383-5p进行靶基因预测,并通过DAVID 6. 8软件对miR-383-5p肝脏靶基因进行GO和KEGG分析。qRT-PCR和Western blot法检测下调BRL-3A细胞中miR-383-5p表达对部分代谢相关靶基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果冷应激后小鼠血清及肝脏中的miR-383-5p相对表达量均显著下降(P 0. 05)。生物信息学方法预测出733个在大鼠肝脏表达的靶基因,GO富集分析结果显示这些靶基因主要与细胞氧化还原过程、增殖和凋亡相关,KEGG分析结果显示富集靶基因最多的信号通路是代谢通路。下调miR-383-5p表达使BRL-3A细胞中Mtor、Pfkfb1和Apbb3基因的mRNA的转录水平显著升高(P 0. 05),Pfkfb1蛋白的表达量显著升高(P 0. 05)。结论冷应激可降低大鼠肝脏中miR-383-5p的表达量,进而通过调节Pfkfb1等靶基因的表达参与细胞的代谢、增殖和凋亡。     

慢性乙肝病毒感染者血清IFN-r、IL-4和IL-12的检测

本研究用ELISA法检验健康人及慢性HBV感染者血清中IFN-r、IL-4和IL-12的水平,观察其与ALT,HBV DNA等临床常用指标的相关性,以了解机体免疫功能,探索准确全面地评价慢性HBV感染者免疫功能的方案及非细胞溶解机制在抗病毒治疗中的应用前景,以期能对抗病毒治疗前免疫功能的评价及抗病毒治疗有所帮助。     

免疫传感器与高分子活性膜

免疫传感器是近十年发展起来的一种新型生物电化学传感器。本文综述了非标记免疫传感器与标记免疫传感器的原理及测定过程。高分子活性膜是生物电化学传感器的核心。本文就高分子活性膜的基质材料、成膜机理、膜的特性以及生物活性物质在膜表面的固定化等方面进行了讨论。     

锌指蛋白转录抑制因子145′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

目的检测锌指蛋白转录抑制因子14(positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14)5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的活性。方法 PCR扩增PRDM14 5′UTR各截短序列的基因及全长基因,分别插入至双荧光素酶和红绿荧光报告基因中,构建重组质粒p RLPRDM14 S1-FL、p RL-PRDM14 S2-FL、p RL-PRDM14 S3-FL及p G-PRDM 14-R。将各重组质粒分别转染HEK293细胞,检测PRDM14 5′UTR IRES元件的活性、内部剪切位点和自身启动子的活性及影响IRES活性的序列。将重组质粒p RL-FL/5′UTR分别转染HCT-8/WT、Hep-2、Bel7402/WT和NIH3T3细胞,检测各细胞中PRDM14 5′UTR IRES元件的活性。结果 PRDM14 5′UTR具有内部核糖体进入位点元件活性;不具有内部剪切位点和自身启动子活性;PRDM14 5′UTR的活性激活中心位于25~60 nt,活性抑制中心位于60~95 nt;除NIH3T3细胞外,其他细胞均具有IRES活性。结论 PRDM14 5′UTR具有典型的IRES活性,为今后深入研究PRDM14表达的调控机制奠定了基础。