重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究

通过测定复性后酶活性和计算蛋白复性收率,研究了L-精氨酸助溶菌酶的最佳复性条件,利用蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型描述了L-精氨酸助溶菌酶复性动力学,在溶菌酶浓度为100~500μg.mL-1、L-精氨酸浓度为0~1.0 mol.L-1的条件下,分析了溶菌酶浓度及L-精氨酸浓度对复性动力学常数的影响。结果表明,L-精氨酸助溶菌酶复性符合三级聚集反应动力学,L-精氨酸的主要作用是抑制蛋白聚集体的生成速率,从而达到抑制蛋白沉淀、提高复性收率的效果。     

明胶微球缓释系统冻干工艺的建立及其溶解释放效果检测

目的初步建立明胶微球缓释系统冻干工艺,并检测其溶解和释放效果。方法制备明胶微球,复溶后,分别加入终浓度0. 5%蔗糖、0. 5%葡萄糖及终浓度0. 5%及0. 25%明胶作为保护剂,进行冻干后,再分别加入100 mL蒸馏水复溶,比较复溶效果,筛选最适保护剂;将小鼠分为冻干IFN明胶微球缓释系统组(IFN-FGMS组)、IFN明胶微球缓释系统组(IFN-GMS组)、IFN组,每组10只,分别经后肢肌肉注射,2. 5×10~4 IU/(mL·只),每隔1 h经眼眶静脉丛采血,连续27 h,分离血清,检测IFNα2b活性。结果终浓度0. 5%蔗糖及0. 5%葡萄糖组可见不溶团块,终浓度0. 5%明胶组微溶,0. 25%明胶组明胶微球澄清透明,确定0. 25%明胶为最适冻干保护剂。IFN-FGMS组达峰时间Tmax分别为IFN-GMS和IFN组的1. 5和3倍,血药峰浓度分别为IFN-GMS和IFN组的82. 7%和62. 8%,血药浓度半衰期为IFN-GMS和IFN组的1. 6和5. 4倍。结论冻干微球缓释系统的缓释作用明显优于未冻干微球缓释系统。     

两性霉素B脂质体冻干粉的制备与性质

目的：以薄膜分散法制备两性霉素B脂质体冻干粉(AMB-Lip-FDP),并进行其质量评价。方法：采用薄膜分散法制备AMB-Lip-FDP,考察冻干工艺对AMB-Lip-FDP外观、溶解性、粒径和包封率的影响，并对制备的冻干粉性质进行表征。结果：采用薄膜分散法制备的AMB-Lip-FDP为黄色蓬松粉末，溶解性好，略有引湿性，复溶后的平均粒径为(110.2±3.6) nm, PDI为0.187±0.026,Zeta电位为(-42.6±1.4) mV,包封率为93.6%±2.7%,稳定性较好。体外释放结果表明，PBS中48 h释放约65%,具有明显的缓释性。5%葡萄糖注射液稀释，室温48 h稳定。结论：采用优化后工艺制备AMB-Lip-FDP稳定可行，具有明显缓释特征，为该产品的生物等效性评价提供研究基础。     

反相色谱法研究人粒细胞集落刺激因子的离子交换色谱复性和稀释复性

以反相色谱分析为主要手段,结合活性测定,研究了以包含体形式表达的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的稀释复性和离子交换色谱复性. 建立了L-精氨酸离子交换复性蛋白质的方法,将变性、还原的rhG-CSF吸附到高浓度变性剂平衡的离子交换色谱柱上,用L-精氨酸作洗脱剂进行梯度洗脱并同时脱除变性剂,实现了rhG-CSF的复性. 与稀释复性相比,色谱复性的rhG-CSF处于一种中间状态,呈现快速而不同步的动力学特点,这与色谱复性的梯度洗脱及固定相的吸附有关. 同时发现了对复性峰进一步稀释并且温育则可以提高其活性的新现象.     

大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的纯化与复性研究

目的纯化、复性大肠杆菌表达的vMIPⅡ包涵体蛋白。方法用8molL尿素缓冲液变性溶解vMIPⅡ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除SDS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。结果重组vMIPⅡ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。结论已获得了重组vMIPⅡ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。     

氯化钠含量对人凝血因子Ⅷ冻干品结晶形态的影响

目的研究人凝血因子Ⅷ(FⅧ)中氯化钠含量与冻干品结晶形态的关系,为FⅧ冻干品的质量控制提供依据。方法采用阴离子交换凝胶柱层析法制备高纯度的FⅧ溶液,分别加入氯化钠至低中高浓度(40、80、160 mmol/L)后,真空冻干,并与添加160 mmol/L氯化钠和100 mmol/L甘氨酸的冻干品进行对比。目测法观察冻干品外观,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察结晶形态;差示扫描量热法(differential scanning calorimeter,DSC)检测热力学性质;参考《中国药典》三部(2010版)检测FⅧ活性、含水量、复溶时间。结果 FⅧ溶液随着盐浓度增加,冻干品外观依次变差,由疏松网孔状结构变致密片层状结构,共晶点降低,凝血活性降低,复溶时间延长,含水量增加;添加甘氨酸作为保护剂的冻干品外观明显变好,呈疏松网孔状结构,共晶点高,凝血活性强,复溶时间短,含水量低。结论氯化钠含量对冻干品结晶形态有显著影响,可在溶液配制阶段调节氯化钠含量及添加保护剂,以控制冻干品的结晶形态。     

与环境友好的化学-生物法制备D-精氨酸和L-瓜氨酸

L-精氨酸在水溶液中利用自身所产生的碱性溶液,用n(水杨醛):n(1-精氨酸)=0.1:1的水杨醛为催化剂,L-精氨酸可以快速消旋为DL-精氨酸.后以DL-精氨酸为底物,利用粪链球菌(streptococcus faecalis)精氨酸脱亚胺酶对L-精氨酸的专一脱亚胺作用,同时制备D-精氨酸和L-瓜氨酸,分别以92.3%、94.2%产率获得光学纯的D-精氨酸和L-瓜氨酸.     

离子液体协同催化合成游离氨基酸酯

以L-氨基酸和醇为原料,酸性离子液体辅以少量强酸性阳离子交换树脂作催化剂,直接酯化合成了8种游离的L-氨基酸酯,并用1HNMR对产物进行了表征。通过L-苯丙氨酸正丁酯的合成对离子液体的活性进行了考察,结果表明,所选用的11种离子液体在反应过程中均起到了一定的催化作用和助溶作用。其中,[Hmim][HSO4]效果较好,在重复使用后,显示了较好的稳定性,是氨基酸酯化反应理想的催化剂和助溶剂。     

不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活猪细小病毒效果的影响

目的研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响。方法取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C 3种配方(氯化钠浓度为C6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的最佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测。结果在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为最佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02)LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)%。结论已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性。     

促肝细胞生长素冻干粉针剂的性状与结构

借助X-衍射分析和显微成像研究促肝细胞生长素原药、辅料及冻干粉针剂的结构,结合对冻干制剂的含水量以及水溶解时限的测定,确定注射用促肝细胞生长素的合理冻干时间。结果表明,促肝细胞生长素原药和右旋糖酐溶液的冻干品为无定形结构,右旋糖酐不影响甘露醇的结晶,促肝细胞生长素多肽链干扰了甘露醇的结晶并使其晶型发生改变。当冷冻干燥时间低于30 h时,产品的组成是不均一的。因此,冻干粉针剂的结晶相由其中甘露醇的结晶构成,甘露醇的晶粒构成了粉针剂的骨架支撑材料,无定形的右旋糖酐是促肝细胞生长素的保护剂和分散剂,而形成性状良好的促肝细胞生长素冻干粉针剂所需冻干时间为36小时。     

重组小纤溶酶的制备及其生物学活性

目的制备重组小纤溶酶,并检测其生物学活性。方法将重组质粒pET11a-miniPlg转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达。收获菌体,提取包涵体,经复性、层析纯化、尿激酶激活,制备小纤溶酶。进行初步理化鉴定后,采用生色底物法测定其体外活性,采用动物模型进行体内溶栓试验,并与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行比较。结果小纤溶酶的表达量约占菌体总蛋白的30%～35%,纯化收率约为15%,得率为4.93mg/g菌体湿重,相对分子质量为38527,N-、C-端氨基酸序列与理论值一致。制备的小纤溶酶比活性为115IU/mg,动物模型溶栓试验中表现出良好的溶栓效果,对纤溶系统和凝血系统影响轻微。结论所制备的重组小纤溶酶具有良好的生物学活性,溶栓效果及安全性均优于rt-PA。     

光辅助引发制备较高阳离子度的P(AM-DMDAAC)

以丙烯酰胺(AM)与二甲基二烯丙基氯化铵(DMDAAC)为原料,氧化还原剂-偶氮盐为引发体系,采用光辅助引发聚合法对阳离子度分别为30％和40％的P(AM- DMDAAC)的制备进行了研究.考察了引发剂用量,单体质量分数,引发温度、pH值、助溶剂和络合剂用量等因素对聚合物特性粘数及溶解性的影响.结果表明,当阳离子度为3...     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性

目的　研究大肠杆菌重组人成骨蛋白 1的非诱导表达特性。方法　通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP 1非诱导表达的影响。通过传代实验 ,考察该系统OP 1表达的稳定性。结果　水质对OP 1的表达没有明显影响 ,2 %～ 4 %的接种量有利于OP 1的表达 ,起始pH以 6 0为宜。葡萄糖对OP 1的表达有较大影响 ,2 %～ 4 %的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP 1的表达 ,最适添加量为 0 3% ,较对照提高表达 81 7%。该表达系统对溶氧的需求不大 ,装液量和转速分别以 12 5～ 15 0ml和 15 0r min为宜。在优化条件下 ,最适表达时间为 2 4～ 2 6h ,OP 1的表达量可达到菌体蛋白的 4 0 %。优化的营养条件和培养条件对本系统OP 1的表达和质粒的稳定有利 ,10次传代可保持 90 %表达。结论　建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺 ,对其非诱导表达特性有了较为深入的了解 ,为进一步放大研究奠定了基础。     

Enzymatic modification of proteins of commercial sesame meals (Sesamum indicum, L.)

Sesame (Sesamum indicum, L.) is one of the most important oilseed crops in Venezuela. However, the low solubility of the flour made of commercial meals does not allow its use in the preparation of fluid foods. To solve this situation, the alternative of solubilizing the sesame proteins by an enzymatic method, using commercial proteases, was studied. Hydrolysis was carried out with two types of bacterial proteases: neutrasa 0.5L, and alcalase 0.6L. Basically, the process consisted of milling and sieving the sesame cake (60 mesh), concentrating the proteins by solubilizing them at a pH of 9.5, and then precipitating at a pH of 4.5. Proteins were hydrolyzed by an enzymatic method, and the hydrolysates freeze-dried and spray-dried. Optimal conditions of hydrolysis using neutrase 0.5L at a pH of 7 were: 6% substrate concentration, 3% enzyme:substrate ratio, temperature 50 degrees +/- 1 degree C, and hydrolysis degree of 8%. When alcalase 0.6L was used at a pH of 8, optimal conditions were: 8% substrate concentration, 2.3% enzyme:substrate ratio, temperature 58 degrees +/- 1 degree C, and hydrolysis degree of 10%. The enzyme affinity (Km) was best at temperatures near the optimal temperature for the hydrolysates. Dried hydrolysates had protein values which ranged between 66.3% and 66.9% and a nitrogen solubility in water, of approximately 85%. Hydrolysis yields referred to the concentrate dried mass were 42% for the atomized hydrolysate, and 56% for the freeze-dried one. In conclusion, the enzymatic hydrolysis process improved the nitrogen solubility in water of the sesame proteins.     

重组MVA病毒载体疫苗的冻干保护剂研究

目的研制重组MVA病毒载体疫苗的耐热冻干保护剂。方法在重组MVA病毒载体疫苗中加入不同配比的保护剂,在适宜的条件下制备成冻干剂型。根据冻后外观、病毒滴度和热稳定性等结果,筛选出保护剂的最适配方。结果以海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和肌醇等按比例、配伍而成的保护剂,对MVA病毒载体疫苗显示了较好的保护性,疫苗冻干前后病毒滴度下降在0.12LgPFU/ml以内,37℃放置1周,滴度下降0.35LgPFU/ml左右;放置3周,滴度下降不超过1LgPFU/ml。而无保护剂的液体疫苗对照于37℃放置1周,滴度下降近1LgPFU/ml;放置3周,滴度下降3.5LgPFU/ml左右。结论以海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和肌醇等配伍而成的保护剂是一种良好的疫苗保护剂。     

树枝状大分子聚酰胺胺对布洛芬的增溶性能研究

采用发散合成法,合成了系列以乙二胺为核的树枝状大分子聚酰胺 胺(PAMAM)和三羟基氨基甲烷改性的聚酰胺 胺,用紫外 可见分光光度计测定了树枝状大分子对布洛芬的增溶能力。结果表明:两类树枝状大分子对布洛芬的增溶量均高于传统的表面活性剂SDS,而且增溶能力均随代数的增加而增加;在引入羟基后,PAMAM增溶能力明显提高,作为一种新型的药物输送剂,显示了良好的应用前景。     

重组人白细胞介素-18的纯化、复性及其活性检测

目的纯化和复性rhIL18,并测定其生物学活性。方法采用提取包涵体、分子筛层析及离子交换层析的方法纯化rhIL18,经稀释法复性,用IL18诱导PBMC产生IFNγ,ELISA法检测上清中IFNγ的水平。结果rhIL18纯度大于95%,复性回收率达30%以上,获得的产品可诱导PBMC产生大量的IFNγ,且呈剂量依赖关系。结论该纯化、复性方法为大量生产rhIL18打下了基础。