磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺研究

本文研究了磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺,实验结果表明有机相和水相比例、磷脂酰胆碱(PC)浓度、反应温度、水相pH以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺为:有机相和水相的比例为4/4、PC浓度为75mg/mL、反应温度为40℃、水相pH值为4.0、反应时间为12h,在此工艺条件下磷脂酰丝氨酸得率为:68.9%。     

磷脂酶D的制备及催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸

选用穗色链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)作为磷脂酶D的生产菌株进行了酶的制备及条件优化,并在两相体系中进行了酶催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸的研究。结果表明,最适的产酶条件为葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、鱼粉蛋白胨5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化钙3 g/L,接种量1%、培养基初始p H 7.0、培养温度30℃,在最适产酶条件下酶活达到2 967 U/L,是优化前的2.12倍;最适的催化工艺条件为有机相二氯甲烷、反应温度35℃、p H 5.5、酶用量1.15 U/m L、钙离子浓度10 mmol/L,在该催化工艺条件下反应10 h后磷脂酰胆碱的生成率达94%。     

磷脂酶D催化高温降解后大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

研究以粗大豆卵磷脂为原料,经过高温降解后采用含磷脂酶D发酵液催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺。为了确定高温降解粗大豆卵磷脂的最佳工艺,设计了相应的正交试验。结果表明,通过正交试验优化,以1倍体积水饱和的乙酸丁酯为溶剂,127℃降解40 h能够有效改变粗大豆卵磷脂中其他磷脂的结构和化学性质,有利于磷脂酰胆碱的进一步纯化。通过甲醇提纯后进一步通过磷脂酶D发酵液催化合成磷脂酰丝氨酸,最后采用无水乙醇作为产品的提纯溶剂进行分离纯化,最终得到磷脂酰丝氨酸含量为48.45%的产品。     

磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

研究了磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸(PS)的工艺,单因素实验结果表明,用水量以及粗大豆磷脂(磷脂酰胆碱:25%)的比例、L-丝氨酸用量、反应温度以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用单一水相法通过磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺参数如下:用水量-粗大豆磷脂的比例为2:1、丝氨酸浓度为0.6g/m L、反应温度为50℃以及反应时间为30h。在此工艺条件下在该工艺条件下主要通过减少水的用量以及增加丝氨酸的用量能够有效克服单一水相法的缺点,抑制磷脂酶D的水解活性,最终使反应体系中磷脂酰丝氨酸的含量为15.78%,PS的转化率约为63.12%。该工艺相比有机溶剂-水双相反应更具优势,在此基础上,该工艺有望通过进一步的研究以提高反应过程中PS的转化率。     

生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的研究进展

近年来的研究表明,磷脂酰丝氨酸具有预防老年痴呆症、改善记忆力等功能。但是天然存在的磷脂酰丝氨酸很少,提取工艺繁杂,并且产品安全性受到人们质疑。生物酶法制备磷脂酰丝氨酸具有反应条件温和、环境友好、产品质量好等优点,近年来受到越来越多的关注。从用于生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的酶和反应体系等方面综述了国内外生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的相关研究进展,并指出开发稳定高效的酶制剂和探寻绿色安全的新工艺等措施有助于促进生物酶法工业化生产磷脂酰丝氨酸。     

磷脂酰丝氨酸的酶法制备与分离研究进展

磷脂酰丝氨酸(PS)的制备有溶剂提取法、化学合成法和酶转化法。采用溶剂提取法从动物组织提取PS由于"疯牛病"原因而受质疑;化学合成法成本较高,工艺复杂,且纯度和收率有待提高;酶转化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单的优势,越来越受到关注。主要对磷脂酰丝氨酸的酶法制备以及分离纯化方法进行了综述,对其生产制备过程提出了合理的建议和策略。     

磷脂酶D特性及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）是一种新资源食品,在自然界中含量稀少,提取困难。磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）是生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的关键合成酶。本文主要介绍了PLD的分子结构特点、催化机理及酶活特性,并总结了目前PS的制备方法,重点对PLD酶催化制备磷脂酰丝氨酸的研究进展及反应体系进行了论述,并对催化制备PS反应体系的选择进行了分析和展望,以期为深化酶法技术制备PS的研究提供参考,以此推动新资源食品PS的工业化生产和应用。     

蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(<35%)而水解反应转化率过高(>30%)。在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。结果表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLD^{Y405A/Q407G/D370P/K478P},转化率、PS产量、k_cat/K_m分别为55.6%、42.3 g·L^-1、1.53(mmol/L)^-1s^-1,比野生型分别提高了59.8%、59.6%、93.7%。PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6 ų,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6 Å,与H₂O O原子的距离(d2)增加0.8 Å。在3 L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L^-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础。     

磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质。在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化。成功构建了重组菌株E. coli BL21 (DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 k Da。重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38. 58 U/m L,是优化前的2. 26倍。PLD粗酶液的最适p H值为7. 5,最适反应温度为60℃。制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 m L的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 m L酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28%,产量为1. 34 g/L。该PLD粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础。     

固定化磷脂酰胆碱水相酶催化合成磷脂酰丝氨酸

本文构建了一种固定化底物磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)水相催化体系,磷脂酶D转化PC合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)新技术。探讨了沉淀剂种类、载体类型和底物初始添加量等主要因素,对固定化底物PC过程中PC吸附率的影响,获得了最佳工艺参数。在此基础上,进一步研究了固定化底物PC酶法合成PS的时间反应动力学和酶重复利用特性。结果表明,催化反应24 h后,PS得率为98.74%,磷脂酶D重复使用10次,PS得率仍然大于60%。文章还比较了固定化底物水相催化体系和双液相催化体系酶法合成PS效果,结果发现,固定化底物水相催化体系中PS得率和酶循环利用特性均优于双液相催化体系。本文研究结果为今后酶法改性PC合成PS提供了一种新的催化反应体系。     

复合磷脂酶水相体系酶法制备甘油磷脂酰胆碱的研究

采用复合磷脂酶在水相体系中酶解大豆卵磷脂制备甘油磷脂酰胆碱(GPC),磷脂酶A1和磷脂酶A2复合酶解作用,不仅有效地缩短了酶解时间,更能提高GPC的得率。通过响应面优化试验确定最佳酶解条件为:底物质量浓度61 g/L,酶解温度45.2℃,磷脂酶A1添加量16.86 U/m L,磷脂酶A2添加量21.98 U/m L,Ca Cl2添加量5.18 g/L。在最佳酶解条件下酶解2 h,GPC得率平均值为96.25%。     

低温贮藏中桃果实磷脂酶D活性的测定

以"大团蜜露"水蜜桃果实为试材,通过酶联比色法对水蜜桃果实中磷脂酶D活性进行了测定,并对影响酶活性测定结果的因素进行了研究,建立了用于测定桃果实组织磷脂酶D活性的方法。在200μL反应体系中,膜蛋白含量和浓度分别以10μg和10mmol/L为宜。通过分析正丁醇和水杨酸处理的水蜜桃在低温贮藏中果实样品酶活测定结果得出,该测定方法具有高效便捷、灵敏度高、危害低和结果稳定的优点,可用于桃果实组织中磷脂酶D活性变化的研究。     

磷脂酰丝氨酸的提取分离研究进展

磷脂酰丝氨酸作为人类大脑的益智物质,已经得到了广泛关注.主要对磷脂酰丝氨酸的提取和纯化方法进行介绍.提取方法包括氛仿-甲醉法、叔丁基甲醚法、乙酸乙酯-乙醇法等.纯化的方法涉及薄层色谱法、柱色谱法、高效液相色谱法等.磷脂酰丝氨酸提取工艺复杂,需使用大量有机溶剂,今后需加强提取工艺的优化.     

磷脂酶A1(Lecitase Ultra)的纯化及氨基酸序列分析

本论文研究了超滤法和RP-HPLC对磷脂酶A1(Lecitase Ultra)的纯化,利用MALDI SYNAPT Q-TOF MS和MS/MS对其氨基酸序列进行分析及推测。纯化去除了Lecitase Ultra中的山梨醇和山梨醇盐,纯度97.7%,酶蛋白和亚基的分子量为30838.0和16536.0。通过MALDI SYNAPT Q-TOF MS和MS/MS对酶蛋白进行分析,确定了Lecitase Ultra的氨基酸序列组成;进行数据库(http: //www.matrixscience.com)比对,发现其氨基酸序列信息与棉状嗜热丝孢菌(T. lanuginosus)脂肪酶和尖孢镰刀菌(F. oxysporum)脂肪酶高度吻合,序列中1-284是T. lanuginosus脂肪酶的氨基酸序列,序列中285-339是脂肪酶F. oxysporum脂肪酶的氨基酸序列,其中113、118和121可能是被基因突变成113 G-A、118 D-W和121 E-K。研究结果为进一步探讨Lecitase Ultra的三维空间结构及其活性中心催化机理提供了数据支撑。     

蜡样芽孢杆菌产磷脂酶D发酵条件优化

通过单因素和正交试验,对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）产磷脂酶D发酵条件进行了优化。结果表明,培养基最佳组成为卵黄10 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉粉2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、氯化钠3 g/L;最佳发酵条件为：培养基初始pH8.0,接种量1.0%,于36 ℃,200 r/min培养8 h。在最适发酵条件下磷脂酶D酶活达4.21 U/mL。     

大豆油酶法脱胶的生产应用

以大豆毛油为原料,添加磷脂酶进行酶法脱胶,通过生产实际应用,确定酶法脱胶工艺参数为:磷脂酶A1和磷脂酶C混合酶用量45 mg/kg,pH 5,加水量2％,反应温度52℃,反应时间2h.在此条件下,脱胶油磷含量可降至5 mg/kg,精炼成品油总磷含量可降至1.4 mg/kg,非水化磷脂去除率达到99.3％以上,精炼成品油得率可达97.3％.对比特殊脱胶方法,精炼成品油经济效益提高了74.42元/t.