纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶特性分析

分离鉴定溶栓酶高产菌株,对其所产溶栓酶的类型、相对分子质量及发酵曲线进行特性分析。从中国豆豉中分离一株纤溶酶高产菌株MX-6,经个体形态、菌落形态及16S r DNA基因同源性比对,确定该菌株为枯草芽孢杆菌。应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆到1 473 bp的纤溶酶编码基因apr N,根据推测氨基酸序列与同源序列的多序列比对及系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-polyacrylamide gels electrophoresis,SDS-PAGE)确定枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的相对分子质量约28 ku,与预测的相对分子质量27 712. 72 u相吻合。枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的发酵曲线结果显示在72 h达到纳豆激酶最大合成量,在纤维蛋白平板上的溶圈直径高达21. 60 mm。为更好地实现纳豆激酶的开发及应用提供一定的理论依据和方法参考。     

高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化

以黄豆为主料,添加不同辅料,采用不同处理方式,以产酶活力为指标研究三株枯草芽孢杆菌发酵性能,筛选优势菌株进行固态发酵,确定最优工艺条件。结果表明:在三株受试菌种中BS21076发酵性能最优,活菌数及纳豆激酶活力均较高;最优固态发酵条件为:大豆90℃下烘炒5min,破碎度为四瓣,魔芋精粉添加量3%,接种量为8%,37℃下发酵24h;在此条件下,酶活力可达(3582.48±83.13)U/g,较传统发酵NK活力极显著(p0.01)提高。     

高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化

以黄豆为主料,添加不同辅料,采用不同处理方式,以产酶活力为指标研究三株枯草芽孢杆菌发酵性能,筛选优势菌株进行固态发酵,确定最优工艺条件。结果表明:在三株受试菌种中BS21076发酵性能最优,活菌数及纳豆激酶活力均较高;最优固态发酵条件为:大豆90℃下烘炒5min,破碎度为四瓣,魔芋精粉添加量3%,接种量为8%,37℃下发酵24h;在此条件下,酶活力可达(3582.48±83.13)U/g,较传统发酵NK活力极显著(p<0.01)提高。      

高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选,得到了具有较高纤溶活性的四株,考虑到发酵后的纳豆感官,我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种.根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较,初步判断这两株菌株为枯草茅孢杆菌（Bacillus subtilis）.     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

以豆粕粉为氮源的枯草芽孢杆菌液态发酵生产纳豆激酶

枯草芽孢杆菌液态发酵通常采用蛋白胨作为氮源生产纳豆激酶,导致生产成本过高,发酵液中酶活性较低。采用价格低廉的豆粕粉作为氮源不仅大幅度降低了原料成本,而且显著提高了发酵液中的酶活性。在摇瓶实验中优化确定豆粕粉最佳添加量,并在此基础上优化确定了最佳接种量、发酵液初始p H、发酵时间。最终摇瓶发酵液中酶活达到5 471 IU/m L,是等量胰蛋白胨作为氮源发酵的3.6倍。上述摇瓶发酵参数进一步在7 L发酵罐和200 L中试水平发酵罐进行验证,并优化确定发酵过程中控制溶氧水平为30%,纳豆激酶活性分别达到6 717 IU/m L和4 236 IU/m L。     

带自身启动子的bgaB基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的启动子连同β-半乳糖苷酶bgaB基因经PCR扩增后,连接在T载体上,再取代枯草杆菌载体pZ01-bgaB的启动子,将其在枯草杆菌宿主WB600中表达.经摇瓶发酵20h,得到乳糖酶活力6.37U/mL,比活力3.814U/mg,SDS-PAGE电泳显示有明显重组蛋白质条带.证明了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的启动子在枯草杆菌中是完全适用的.     

响应面法优化枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶发酵条件

以分离于纳豆中的枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,通过单因素试验确定温度、初始pH值、接种量、装液量及摇床转数对纳豆激酶活力的影响,应用响应面法的Box-Behnken设计对纳豆激酶发酵条件进行优化。当温度36.69℃、初始pH 6.94、接种量3.03%、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min时可获得最大的纳豆激酶溶圈直径20.71 mm,与优化前的溶圈直径相比提高35.54%,表明该模型能科学地预测纳豆激酶的合成情况。结果显示响应面法可有效、成功地优化纳豆激酶发酵条件。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

助朋基因在Bacillus subtilisWB800中的克隆表达

对源自Bacillus subtilis168的具有纤溶活性的基因序列（WprA）进行克隆,然后将wpra基因克隆到大肠杆菌．枯草杆菌穿悛载体pBE3中,构建表达载体pBE-WprA,将重组载体转化到Bacillus subtilisWB800中,实现了WprA基因在Bacillus subtilisWB800中的表达。结果表明,WprA基因在Bacillus subtilisWB800中的对数生长期和平衡期均获得了表达,且产物被分泌到胞外。     

纳豆激酶稳定性的研究

纳豆激酶是一种新型溶栓酶 ,具有溶栓效率高、药效时间长以及无毒副作用等优点。实验研究了pH、温度、金属离子以及某些有机物质对该酶稳定性的影响。实验表明 ,该酶在 4 5℃以下和 pH 7～ 9范围内酶活相对稳定 ;Mg2 +和Co2 +离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 +、Zn2 +和Al3+等离子对该酶有明显的抑制作用 ;牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、甘油、丙二醇和海藻酸钠等能显著提高酶的耐热性 ,其中以明胶的作用最为明显。这些发现对液体酶的生产有重要指导作用     

响应面法优化纳豆激酶液体发酵

用响应面法对Bacillussubtilis液体发酵生产纳豆激酶的培养条件进行了优化。首先用Plackett Burman方法对相关影响因素的效应进行评价并筛选出了有显著正效应的胰蛋白胨和有显著负效应的种龄、发酵温度和Na2 HPO4浓度等 4个因素 ,其他因素对纳豆激酶产量无显著影响。第 2步用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域。最后由中心组合实验及响应面分析确定了主要影响因素的最佳条件。在优化培养条件下 ,液体发酵液中纳豆激酶浓度从10 0 5 73IU/mL提高到 13 14 48IU/mL。     

Enhancement of Recombinant Subtilisin YaB Production by Bacillus subtilis

Bacillus subtilis is an ideal host for the production of extracellular heterologous proteins. The use of a strong, constitutive promoter is a good means of optimizing the expression of heterologous proteins. In this study, high level extracellular production of subtilisin YaB, a potent meat tenderizer, was achieved by engineering the wild-type subtilisin YaB promoter into an artificial promoter and expressed in Bacillus subtilis host. This artificial promoter provides an efficient tool to produce mutant subtilisin YaB or other recombinant heterologous proteins by B. subtilis at high level.     

Enhancement of Recombinant Subtilisin YaB Production by Bacillus subtilis

Bacillus subtilis is an ideal host for the production of extracellular heterologous proteins. The use of a strong, constitutive promoter is a good means of optimizing the expression of heterologous proteins. In this study, high level extracellular production of subtilisin YaB, a potent meat tenderizer, was achieved by engineering the wild-type subtilisin YaB promoter into an artificial promoter and expressed in Bacillus subtilis host. This artificial promoter provides an efficient tool to produce mutant subtilisin YaB or other recombinant heterologous proteins by B. subtilis at high level.     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。