黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

北京棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的克隆与表达产物活性测定

以北京棒杆菌E31染色体DNA为模板,用PCR法扩增了高丝氨酸脱氢酶(HD)基因。将结构基因装载于pET-28a质粒的T7启动子下游,得到了重组表达质粒pET-HD。将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明,高丝氨酸脱氢酶的活性为不含重组质粒的对照菌的10倍。     

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD 19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。     

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a(+)中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL(DE3)中,表达产物有酶活。     

单核细胞增多性李斯特菌iap 基因的克隆、表达与p60 蛋白的纯化

以单增李斯特菌基因组DNA 为模板,利用自行设计的引物,通过PCR 法扩增出单增李斯特菌的iap 基因。在iap 基因的5 ＇端和3 ＇端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点将其克隆到pMD-18T 载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap 基因克隆至表达载体pET-28a 上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG 诱导下,携带pET-28a-iap 的E.coli BL21(DE3)高效表达分子质量约为60kD 的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白含量的76.3% 左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+ 亲和层析柱纯化得到纯度在95.6% 以上的重组p60 蛋白,其提取率为68.3% 左右。     

超表达葡萄糖脱氢酶促进大肠杆菌生长

通过PCR扩增了肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)各自的葡萄糖脱氢酶基因KPgdh和ECgdh,构建了表达载体p ET-28a-KPgdh和p ET-28a-ECgdh,转化大肠杆菌E.coli BL21,获得了重组菌BL21(p ET-28a-KPgdh)和BL21(p ET-28a-ECgdh)。经IPTG诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组菌实现了葡萄糖脱氢酶的高效表达,且葡萄糖脱氢酶活性分别是空质粒对照菌E.coli BL21(p ET-28a)的8.5倍和12倍。重组菌的生长速度快于空质粒对照菌E.coli BL21(p ET-28a),并与原代菌E.coli BL21持平。如果扣除质粒复制造成的代谢负荷,过表达葡萄糖脱氢酶促进了大肠杆菌的生长。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC—SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC—SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物进行Ni^2＋-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a—EC—SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E．coli BL21（DE3）后,重组蛋白获得表达,Ni^2＋-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85％以上,经噻唑蓝（MTT）法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC—SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC—SOD3．凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

β-伴大豆球蛋白α-亚基核心区的基因克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术获得了齐黄34大豆种子的全长cDNA,采用自行设计的引物对目的基因αc进行扩增,并将目的基因与载体连接,构建了重组克隆载体pGEM-α_c。重组克隆载体经XhoⅠ/EcoRⅠ双限制酶酶切鉴定后,与载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-α_c,经菌落PCR、双限制酶酶切及测序判定准确后,将其转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,当诱导温度为37℃、菌液OD_(600nm)值为0.8、诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol/L,诱导时间为9h时,重组α-亚基核心区蛋白分子质量为50kU;工程菌pET-28a-α_c-BL21经超声破裂、低温离心后,上清液利用镍离子亲和层析色谱柱经AKTA蛋白纯化系统纯化可以获得较高纯度的目的蛋白。     

苯乙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达及静息细胞生物转化乙基香兰素的研究

对恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida ATCC12633)中的苯乙酮酸脱羧酶基因mdlC进行克隆,导入质粒载体pET28a中,将构建得到的重组质粒pET28a-mdlC转化于宿主细胞E.coliBL21(DE3),重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-mdlC)经IPTG诱导,SDS-PAGE分析得到相对分子质量约为57 000的蛋白质条带。将E.coli BL21(DE3)(pET28a-mdlC)和E.coli BL21(DE3)(pET30a-mdlB)两株重组菌以混合静息细胞的形式作为生物催化剂,利用各自胞内的重组酶对3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸(乙基扁桃酸)脱氢氧化、脱羧合成乙基香兰素。未经优化,催化24 h后反应液中乙基香兰素的质量浓度可达1.94 g/L,且没有副产物产生。同时研究表明,该混合静息细胞重复使用3次能保持90%以上的催化活力,还有效缩短了反应时间。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

双歧杆菌源亚油酸异构酶的原核表达及功能分析

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase, BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体，构建组氨酸标签分别位于C端和N端的重组载体pET-28a(+)-bbi-His和pET-28a(+)-His-bbi,分别实现其在BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS和Rosetta(DE3) 3种类型的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中的异源表达和条件优化。结果表明表达BBI的最优重组菌为E.coli Rosetta/pET-28a(+)-bbi-His,最佳诱导条件为以1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导8 h,且当用BBI粗酶转化脂肪酸时，相较于亚油酸和γ-亚麻酸，BBI更偏好转化α-亚麻酸。     

Bacillus sp.nov SK006中纤维蛋白溶解酶的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术从Bacillus sp.nov SK006中扩增得到纤维蛋白溶解酶(Fibrinolitic enzymes,FE)基因的DNA片段,将其连接到pMD-T载体上,经测序后克隆至载体PET-22b(+),转化至E.coli BL21(DE3)中,得到的重组菌能高效表达FE。诱导表达后,SDS-PAGE显示,重组FE分子量约为28 ku。     

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表达

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于α-淀粉酶家族(α-amylase family),是生物体内通过TreS途径生成海藻糖的一种酶类。利用PCR技术,从水生栖热菌FL-03菌株FL-03中扩增了海藻糖合酶基因(TresC01),将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),得到重组质粒P-TresC01,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为110ku的特异条带,并经Western blotting分析鉴定,表明成功构建重组质粒P-TresC01并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究奠定基础。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶（xylB）的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.