抗CD3基因工程嵌合抗体片段Fab‘的构建,表达和活性测定

ＰＣＲ扩增抗ＣＤ３单抗轻链可变区和重链可变片段基因，将其重组到Ｆａｂ’表达载体中，构建成抗ＣＤ３嵌合抗体Ｆａｂ’表达载体，转化大肠杆菌１６９Ｃ９进行可溶性表达。产物经蛋白Ｇ亲和层析柱纯化。免疫荧光竞争结合实验和＾３Ｈ反故实验证实能与小鼠抗ＣＤ３ＩｇＧＨＩＴ３ａ竞争性结合表达ＣＤ３的Ｔ淋巴细胞，并促进细胞增殖。     

嵌合抗CD20 Fab′诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD2 0基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制 ,利用3H掺入法测定嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞生长的影响 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD2 0Fab′诱导Raji细胞凋亡作用 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD2 0Fab′通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

嵌合抗CD20抗体Fab‘片段三维结构的同源模建

分别以抗CD20Fab‘轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白储备参考蛋白,利用Insight II/MSI的同源蛋白质结构模建系统（homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后,搭建成抗CD20嵌合抗体片段Fab‘的空间构象,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab‘的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,利用^3H掺入法测定嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞的生长具有抑制作用,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20Fab‘可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD20Fab‘通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F（ab′）2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab′表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重键恒定区CH1C－末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab′表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab′）2表达载体。将该载体转化缩主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab′）在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明：抗CD20F(ab′）2片段具有比Fab′更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体H147与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明：F(ab′）2与Fab′更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长。     

嵌合抗CD_(20)抗体Fab’片段三维结构的同源模建

分别以抗CD2 0 Fab’轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针 ,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白作为参考蛋白 ,利用InsightII/MSI的同源蛋白质结构模建系统(homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后 ,搭建成抗CD2 0 嵌合抗体片段Fab’的空间构象 ,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示 ,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

嵌合抗CD20抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD20抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD20抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中，构建抗CD20抗体IgG的轻链和重链表达载体PK100VL和PGL05VH，并用质脂体法共转染CHO细胞，RT－PCR和ELISA检测结果证实了抗CD20抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD20抗体IgG全分子可与CD20阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab')2的构建、表达和活性测定

从抗CD2 0 Fab’表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C 末端的DNA序列 ,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab’表达载体中 ,构建成抗CD2 0抗体片段F(ab’) 2 表达载体。将该载体转化宿主大肠杆菌 16C9,实现了抗CD2 0 抗体片段F(ab’) 2 在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD2 0 特异结合的F(ab’) 2 活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明 :抗CD2 0 F(ab’) 2 片段具有比Fab’更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI4 7与Daudi细胞表面CD2 0 相结合的能力 ;用MTT法检测所得到的数据说明 :F(ab’) 2 比Fab’更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长     

抗CD3/抗B细胞肿瘤的双功能小抗体的抗肿瘤活性研究

为评价已研制的抗CD3/抗B细胞肿瘤 (CD2 0 + )双功能小抗体的生物学活性 ,采用多种实验方法在体内外对其进行研究。结果表明 :该型双功能小抗体能同时与Ju rkat和Daudi细胞结合 ,并交联两种细胞形成玫瑰花环。它与Jurkat(CD3+ )和Daudi细胞 (CD2 0 + )的结合的亲和常数Ka分别为 3.2× 10 8M- 1和 8.9× 10 8M- 1。在体外该抗体能激活并介导T细胞杀伤Daudi细胞。裸鼠体内分布实验结果表明 :该型抗体可在移植瘤部位富集 ;在人B淋巴瘤裸鼠移植瘤腹腔模型中 ,联合人的PBMC和IL 2 ,该抗体可以杀灭人B淋巴瘤细胞 ,明显延长荷瘤裸鼠的生存时间。     

CD59活性位点相关性基因突变的构建与表达

构建了野生型和突变型CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失（突变1,M1）及C39W40K41→W39W40W41（突变2,M2）,重叠延伸PCR（overlap extension PCR）定点诱变扩增突变基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体（Lipfectamine2000）将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）进行表达。酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MICD59、pIRES—M2CD59和pIRES-WTCD59,突变基因约500bp。G418筛选出了CHO转染细胞的稳定细胞克隆,免疫荧光、ELISA检测筛选MICD59、M2CD59和WTCD59蛋白高表达株,连续传代30代有高表达;补体溶细胞反应显示与野生型CD59相比,突变型M1CD59失去对补体的抑制功能,而M2CD59抗补体活性略增高。证实CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。     

对一个CDR区发生突变的改形抗CD28重链单域抗体的研究

在构建改形抗CD28重链单域抗体时,得到一个具有较高免疫学活性的改形抗CD28重链单域抗体基因序列。其推导氨基酸序列与改形构建时所选的人源抗体的FRs同源性最高;其推导氨基酸序列与鼠源抗CD28半日克隆抗体重链可变区氨基酸序列比较发现,该改形抗体在CDR2区53位缺失Ala氨基酸残基,而在65a位上插入一个Arg氨基酸残基。在CDR3区缺少Asp95,Lys96,GLy97,Tyr98氨基酸残基,在FR3区缺少Lys82a,Ser82b,Leu82c氨基酸残基,由于该序列发生的突变较大,作者进一步对其进行了研究,该改形抗CD28VH单域抗体基因与人c-myc及人IgG3‘CL绞链区基因在大肠杆菌中融合表达,融俣表达包函体经复性,纯化处理后,仍具有较高与人CD28的分子结合活性。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab')2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab'表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C-末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab'表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab')2表达载体.将该载体转化宿主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab')2在工程菌中的可溶性分泌表达.经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F(ab')2活性片段.竞争性免疫荧光实验的结果表明抗CD20F(ab')2片段具有比Fab'更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI47与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明F(ab')2比Fab'更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长.     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体的构建、表达及复性研究

构建了抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体 (scBsAb) ,在大肠杆菌中得到表达。用稀释复性 ,缓慢透析复性和凝胶过滤层析复性三种方法对scBsAb表达形成的包涵体进行复性研究表明 ,凝胶过滤层析复性能有效抑制蛋白的聚集。ELISA检测显示 ,复性后的scBsAb具有较高活性 ,能与相应抗原特异结合。     

Time-Programmed Delivery of Sorafenib and Anti-CD47 Antibody via a Double-Layer-Gel Matrix for Postsurgical Treatment of Breast Cancer

The highly immunosuppressive microenvironment after surgery has a crucial impact on the recurrence and metastasis in breast cancer patients.Program-mable delive...     

抗HIV-1 gp120单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控型表达载体构建及表达

人工合成了能广泛识别HIV—1 gp120的单链抗体(SeFv120)基因和金黄色葡萄菌外毒素A(SEA)基因,将SEA基因第227位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码Ala(A)的密码子GCT,并对两基因进行密码子优化。构建原核温控型表达质粒pBV—120和pBV—SL120,经条件优化,pBV—120和pBV—SL120分别在E．coli BL21(DE3)plys中44℃诱导6h、42℃诱导7h获得最佳表达,表达量分别占菌体总蛋白的27．673％和32．519％。目的蛋白经包涵体洗脱、分子筛层析折叠复性后可与HIV—1抗原条发生良好的结合反应。