胸腺基质淋巴细胞生成素基因的克隆及表达条件的优化

将BamHI和EcoRI酶切过的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)基因片段插入载体pET28a,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了TSLP基因在大肠杆菌中的表达.对表达条件进行了优化,在TB+M9(1∶1)培养基中,37℃下使用终浓度0.4 mmol·L-1的IPTG诱导3 h,重组TSLP的表达量可占全菌蛋白的18.6%左右,比优化前提高了约15%.     

血小板生成素基因的克隆及其初步表达

自 4月龄胎肝中提取总 RNA,经逆转录、多聚酶链反应 (PCR)获得了人血小板生成素 (TPO)全基因 ,长约 10 80 bp。将经限制性内切酶 Nde 和 Hind 双酶切后的 TPO基因与 p RSET A载体相连接 ,转化大肠杆菌后得到两个阳性重组质粒 p T4和 p T10。经核苷酸序列分析证实 ,所克隆的基因与文献报道一致。将 p T4转染 E. coli JM10 9(DE3) ,经 1mmol/ L IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析 ,相对分子质量约 40 0 0 0处可见一条明显的表达带。     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达

目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因,提高其酶活性。方法利用PCR方法,从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pET-22b(+)中,构建重组质粒pET-22b(+)-Trpoperon,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析,并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp,SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2.7和3.2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-Trpoperon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

胰高血糖素基因克隆、表达及鉴定

目的 研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血 糖反应。方法 依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血 糖素基因序列,克隆于ｐＧＥＸ－１Ｎ质粒,转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）菌中,对阳性克隆转化质粒进行ＤＮＡ测序。用ＩＰＴＧ诱导 转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析后,由 Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ酶 进行柱上切割,最后用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到纯化产物。产品用质谱法测相对分子质量,并对Ｎ末端１５个氨基酸测序。 结果ＤＮＡ测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为３４８６Ｊ末端１５个氨基酸序列与理论值相同,产率为 １．９ｍｇ／Ｌ。结论 获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血 糖素。     

大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达

目的　在乳酸乳球菌中克隆与表达大鼠endostatin。方法　采用RNA分离试剂盒从大鼠肾脏组织中提取总RNA ,用RT PCR方法扩增其endostatin基因 ,将该基因克隆进pUC19质粒中 ,转化大肠杆菌DH5a ,提取质粒 ,分离基因 ,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子nisin的pLA14 1质粒连接 ,经电击转化 ,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ90 0 0中 ,转化子在含有氯霉素的GM17培养基上培养。用nisin诱导endostatin表达 ,SDS PAGE和Westernblot鉴定表达产物。结果　表达产物相对分子质量约为 14 0 0 0 ,表达量约为 10mg L。结论　在乳酸乳球菌中可以表达出正确的大鼠endostatin重组蛋白 ,为下一步进行重组蛋白的活性检测以及临床实验提供了依据。     

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA中扩增hp1188基因,克隆入原核表达载体pQE-30,构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2+-NTA树脂纯化,Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整,插入的基因片段全长810bp,与GenBank中的hp1188基因同源性达98%。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600,以1.0mmol/L IPTG诱导4h,表达量最高,破菌上清和沉淀中均有表达,可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47%。重组蛋白纯化后纯度可达90%,并可被H.pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。     

人MCIR基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MCIR基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MCIR为模板，利用PCR方法扩增人MCIR基因，将MCIR基因连接到pfastBacl质粒上，与穿梭载体DH10Bac转座，获得Bacmid-MCIR质粒后，通过脂质体介导，转染Sf9细胞，使其表达重组杆状病毒，经SDS-PAGE检测表达产物，放射受体分析法检测目的蛋白MCIR活性。结果Bacmid-MCIR质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱，在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和，具有生物学活性。结论MCIR基因成功在真核细胞中得到表达。     

Neurturin基因的克隆及其在Vero细胞中的表达

目的克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero细胞中表达。方法用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析。结果重组质粒pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变。结论获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础。     

SEN病毒D亚型部分基因的克隆、表达和鉴定

目的获得序列正确的SENV-D亚型ORF1 C-端蛋白基因,并进行表达。方法用PCR法从SENV阳性血清中获得SENV-D ORF1 C-端基因,测序验证后,构建pQE30-SD重组表达质粒,并转化E.coliM15,进行IPTG诱导表达及Western blot分析。结果获得的SENV-D亚型ORF1 C-端蛋白基因序列正确,表达蛋白相对分子质量约为38 000。经Western blot证实能与阳性血清发生抗原抗体反应。结论已成功获得了SENV-D ORF1 C-端蛋白,为今后进一步研究奠定了基础。