环介导等温扩增技术快速检测肉及肉制品中的牛源性成分

本文以牛源性线粒体细胞色素B(cyt B)基因为模板,采用软件Primer Explorer Version 4设计并筛选出LAMP特异性扩增引物,通过反应体系优化建立了肉及肉制品中牛源性成分的环介导等温扩增技术检测方法,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行了验证,同时采用国标方法和商品化检测试剂盒对市售的12种牛肉及牛肉制品进行对比检测。结果表明该检测方法具有高灵敏度、高特异性和高稳定性,适用于实际的生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。      

基于重组酶等温扩增技术快速检测生鲜肉中猪源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测猪肉中猪源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据猪源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计2对RPA引物,筛选了1对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术的检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 30℃等温扩增条件下,RPA引物的特异性良好,灵敏性可达0.1ng/μL。结论本研究成功建立了猪源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉中猪源性成分的快速鉴定。     

可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分

目的建立生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法。方法根据鸡鸭物种特异性cytb、COX3基因的6个特异性区域设计LAMP引物,在反应前加入羟基萘酚蓝(HNB),在63℃条件下反应45 min;反应结果可以根据颜色变化直接判断,阳性为天蓝色,阴性为紫罗兰色。并对30个肉制品样品进行可视化LAMP和PCR方法平行检测。结果 LAMP方法的最低检出限为1 pg,特异性良好,同时对肉制品中目标物检测的检出限可达到0.01%。结论该方法用于肉制品中鸡鸭源性成分的快速检测,具有操作简单、无需贵重仪器、反应结果肉眼可观察、灵敏度高和特异性强等特点,适合于基层监管部门进行肉制品现场快速检测。     

重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物（微生物）因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物（微生物）因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）、重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification,RAA）和酶促重组等温扩增（enzymatic recombinase amplification,ERA）技术。这3 种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3 种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。     

实时荧光环介导等温扩增技术快速检测牛肉中的大肠杆菌O157

目的 建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification, RF-LAMP)快速检测大肠杆菌(Escherichia coli, EHEC)O157的分析方法。方法 针对大肠杆菌O157编码O抗原的rfbE基因设计引物。对该方法进行特异性验证, 同时对大肠杆菌O157:H7纯培养物的灵敏度和人工污染牛肉的检出限进行测定, 对61份牛肉样品进行RF-LAMP检测, 并与GB 4789.36-2016方法进行比较, 评价RF-LAMP方法的敏感性、特异性和准确度。结果 10株大肠杆菌O157呈阳性结果, 21株非大肠杆菌O157呈阴性结果, 该方法特异性良好。纯培养物检测的灵敏度为5.1 CFU/mL, 人工污染的牛肉样品的检出限为5.1 CFU/g。结论 本研究建立的RF-LAMP技术特异性好、灵敏度高、操作简单, 可实时监测扩增反应, 避免了繁琐的电泳过程, 实现了对大肠杆菌O157的快速检测, 对大肠杆菌O157引起的食源性疾病的预防和控制具有重要意义。     

动物源性成分实时等温扩增检测方法的建立

目的建立一种实时荧光环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测动物源性成分的分析方法。方法根据鸡、鸭、牛、羊物种cytb、COX3、12S rRNA、cytb特异性基因分别设计LAMP引物,反应时加入荧光染料SYTO-9,在63℃条件下反应45min,通过实时检测荧光强度判断反应结果,并进行实时监测。结果实时荧光LAMP方法对鸡、鸭源性成分的检测灵敏度为1pg,对牛、羊源性成分的检测灵敏度为10pg。对熟肉制品中掺杂肉检测时,掺杂鸡肉、鸭肉、牛肉和羊肉的检出限为0.01%。结论该方法可用于快速检测肉制品中动物源性成分,具有操作简单、无需贵重仪器、反应过程可实时监控、灵敏度高和特异性强等优点,适合于基层监管部门的现场快速检测。     

肉制品中牛源性成分的PCR-RFLP检测

根据牛线粒体DNA特异性片段设计出引物,应用PCR-RFLP技术检测出7种生肉和4种加工肉制品中的牛源性成分,并根据线粒体中Cytb保守序列设立内源参照基因检测DNA提取效率。方法简便、快速、适合实验室常规物种检测。     

环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用

随着全球转基因作物商业化种植面积持续增长,转基因成分检测作为转基因作物安全管理的重要技术支撑受到越来越多的关注,世界各国与地区不断致力于转基因成分检测技术的开发。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）技术由于简单快速等特点,近年来在转基因检测领域备受青睐。本文对LAMP技术在转基因成分检测中的最新研究与应用及其发展前景加以综述。     

重组酶等温扩增技术快速检测对虾中的白斑综合征病毒

摘 要: 目的 针对对虾中白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV),分别建立基于国外专利技术的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)方法,基于国内专利技术的重组酶介导等温扩增法(Recombinase-aided amplification, RAA) 方法,并对两种方法进行比较。方法 应用重组酶等温扩增技术在恒温(39℃)条件下完成扩增反应的优势, 调整反应体系中模板DNA和探针浓度, 优化WSSV病毒RPA和RAA两种方法的反应体系, 建立了可靠稳定的等温扩增RPA和RAA快速检测方法,比较了两种方法的特异性、灵敏度、扩增效率和稳定性。。结果 所建立的荧光RPA和RAA方法在恒温39 ℃的条件下特异性检测WSSV, 检测构建质粒DNA的灵敏度可达到1.0×106 copies/μL, 检测实际感染阳性样品的灵敏度可达到1.31×101 pg/μL; RPA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9970, 扩增效率为 98.50%;RAA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9910, 扩增效率为 98.50%。 结论 所建立的基于重组酶等温扩增技术的RPA和RAA方法,特异性好,对于质粒和阳性样品检测灵敏度一致,扩增效率一致,具有很好稳定性。适用于水产品养殖及生产加工和通关口岸进口虾类产品中WSSV病毒的现场快速筛查防控。     

环介导等温扩增技术快速检测沙门菌

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异、高效、快速地扩增靶序列的DNA扩增新技术.以沙门菌(Salmonella spp.)为研究对象,根据其特异性的invA基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP,同时优化了其反应条件,建立了沙门菌的LAMP快速检测技术.结果表明,LAMP的最佳反应条件为外引物浓度5 pmol/L、内引物浓度40pmol/L,Mg2 浓度6mmol/L,dNTP浓度0.8mmol/L,甜菜碱浓度0.8mmol/L,Bst DNA聚合酶8u,反应温度63℃,反应时间1 h.在此条件下,LAMP检测沙门菌DNA的敏感度达10fg/反应,且与其他常见的细菌无交叉反应.其对牛奶样品的检出量为102cfu/mL,适合于食品中污染沙门菌的快速检测.     

重组酶恒温扩增技术在动植物源成分分析中的应用与研究进展

近年来,以肉制品和转基因农作物掺假掺杂为主的动植物源成分分析成为食品安全研究及监管领域关注的重点,对于靶向物检测水平的要求也逐渐提高。重组酶恒温扩增技术是一种具有实用性和发展前景的检测技术,包括重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）和重组酶介导的恒温扩增（RAA）等,因其具备快速便捷、灵敏度高、特异性强等优点,广泛应用于动植物源成分检测及各类分析研究领域。本文综合近年来国内外相关研究,归纳了现有分析检测方法,从引物探针设计、外界影响因素、反应装置和检测途径4个方面对RPA/RAA技术的特点及应用进行概述,并对该领域发展趋势进行展望,为动植物源成分检测方法的完善和重组酶恒温扩增技术的应用提供参考。     

重组聚合酶等温扩增技术快速鉴别玛卡及其制品的研究

应用重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据玛卡特异性基因defensin序列设计筛选了1对可用于扩增的引物,建立了玛卡及其加工产品特异性源性成分的RPA检测方法。该方法具有较高的灵敏性,检测灵敏度达到0.1 ng/L以上,操作方便,可以在室温条件下完成反应,检测可在0.5 h内完成,极大缩短了检测时间,适用于市场上玛卡及其制品的快速鉴别。     

环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型核酸扩增技术,其原理是利用在线软件设计4条特异性引物,在具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下,使模板两端引物的结合处循环出现环状单链结构,以实现恒温条件下的连续快速扩增,该方法具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。目前该技术在国内外已经广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等病原体的检测以及鉴定胚胎性别。本文从LAMP技术的原理、方法改造、检测应用以及与其他检测方法的比较这4方面进行综述,为今后LAMP技术的应用提供理论依据并对未来的发展进行了展望。     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法。根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较。结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌。      

等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展

等温扩增技术是近年来迅速发展的一类核酸扩增技术。相比于PCR,该技术具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及低成本的特点。目前,核酸等温扩增技术在感染性疾病的诊断、基因多态性分析、疫情防治等方面已经有广泛应用,也有文献报道了其在细菌、病毒等病原体检测方面的应用。食源性致病菌和环境中的病原体检测等领域中,等温扩增技术展现了广阔的应用潜力,有望发展成为食源性致病菌检测的重要方法。本文综合国内外文献报道,对环介导等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、切刻内切酶核酸恒温扩增、交叉引物等温扩增、链置换等温扩增、SmartAmp技术等一系列等温扩增技术的原理、特性及其在食源性致病菌检测中的应用情况做一综述,从而为该技术在食源性致病菌检测的实际应用中提供参考和依据。     

食品中单核细胞增生单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

目的 建立食品中单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系。方法 针对单核细胞增生李斯特菌的特异性基因hlyA,筛选出一组特异性强且高效的引物,建立单核细胞增生李斯特菌的RPA检测体系,并进行特异性、灵敏度检测。结果 建立的RPA方法在37 ℃恒温反应仅需30 min,能够特异地检测单核细胞增生李斯特菌,最低模板浓度可低至0.5 ng/μL。人工染菌试验显示,该RPA体系可以有效扩增出每2.5 g样品中人工染菌10⁴ CFU样品中的单核细胞增生李斯特菌。结论 RPA等温扩增方法特异较强、灵敏度较高,具有操作简便、不需要昂贵仪器、常温进行扩增反应等优点,适用于现场检测以及在基层实验室推广应用。