金褐霉素高产相关基因的筛选与表达

通过高效表达金褐霉素生物合成基因簇中的调控基因来提高其产量。本实验从野生金褐链霉菌SYAU0709克隆aurJ3M基因,连接载体pMD19-T并测序。将带有aurJ3M基因的表达质粒pBJAUM转化金褐链霉菌SYAU0709,高效表达aurJ3M基因,获得重组菌株。通过高效液相色谱分析检测,重组菌株的金褐霉素产量提高约6 倍,并且遗传性能稳定,发酵结果说明过量表达aurJ3M基因能够提高金褐霉素的产量。     

前体对金褐霉素生物合成的影响

在发酵液中分别加入乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乙醇、正丙醇、正丁醇作为前体,进行前体的种类选择、加入量及加入时间的优化实验.结果表明,乙醇是比乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、正丙醇、正丁醇更佳的金褐霉素合成前体,正丙醇、正丁醇对金褐霉素生物合成无明显促进作用.在发酵24 h时向发酵培养基中添加体积分数0.2%的乙醇, 金褐霉素产量与不添加前体相比,抑菌直径增加26 mm,具有较好的应用价值.     

色褐链霉菌产磷脂酶D的发酵条件研究

采用单因素试验,对色褐链霉菌产磷脂酶D(PLD)的发酵培养条件和培养基组成进行了优化。结果表明,色褐链霉菌摇瓶发酵最佳条件为:发酵周期7 d,发酵温度28℃,发酵培养基初始pH 6.0,接种量3%,发酵培养基装液量10 mL(100 mL三角瓶),摇床转速200 r/min;培养基最佳组成为:蛋白胨20.0 g/L,可溶性淀粉25.0 g/L,MgSO4.7H2O 0.5 g/L,CaCO3 1.0 g/L,Tween 8020.0 g/L。     

烟草钾离子通道基因NKT5的克隆和序列分析

本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草钾离子(K~+)通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得其3'和5'末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K~+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5'端非编码区190bp、3'端非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明其在烟草吸钾及抗逆过程中的功能及分子机制奠定了基础。     

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

海洋链霉菌KR结构域基因的克隆与分析

酮还原酶（Ketoreductase,KR）是聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）重要的组分,可催化β-酮基的还原,是手性药物合成的重要手段,并在聚酮化合物合成中起着关键性作用。该研究从海洋链霉菌Streptomyces sp. X-66基因组DNA扩增出一条 1 331 bp的KR结构域基因,并进行生物信息学分析。Blast结果显示该序列包括了FAS KR和PKS KR两部分,核心功能区域集中于PKS KR基因部分序列;最大ORF区域拟编码333个氨基酸,理论等电点为4.80,分子式为C1500H2419N433O463S6,不稳定指数为24.85,为酸性稳定蛋白,并有较低亲水性,不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为70 ku。通过氨基酸多序列比对,表明蛋白KR3属于B1型KR;以蛋白KR3氨基酸序列预测并检验其三级结构模型,利用分子对接和可视化分析预测蛋白KR3与配体结合的关键残基为204Thr、206Thr和207Leu,依据相关研究分析蛋白KR3引导底物进入活性中心的结合模式与B型KR较为符合,为进一步研究KR3的功能及新型手性药物和聚酮化合物的合成提供科学依据。     

嗜热链球菌胸苷酸合成酶基因的克隆与序列分析

本研究以嗜热链球菌(S．thermophilus)染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增出胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,thyA)基因,将其克隆入T载体中,转化DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定,PCR扩增鉴定,进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了thyA基因,全长900bp,与国外报道的S．thermophilus ATCC19258 thyA基因同源性达99．9%。这为构建以thyA基因为选择压力的非抗生素抗性载体提供了理论依据。     

吸水链霉菌valG基因的克隆与表达

为提高井冈霉素A的产量,本实验尝试构建吸水链霉菌的多拷贝基因菌株.根据吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis）的糖基转移酶基因（valG）序列设计了1对引物.PCR扩增编码糖基转移酶（ValG）的1269 bp基因后,利用TA克隆构建克隆质粒pMD-19-valG.测序正确后经双酶切构建穿梭质粒pIJ8630-valG.再次测序验证后,经质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞将pIJ8630-valG导入吸水链霉菌中.PCR检测证实重组菌构建成功.HPLC检测发酵产物,发现井冈霉素A的产量达到了1.17 mg/mL,比出发菌株提高了11.2％,valG基因得到表达,为进一步利用valG构建新的高产菌株奠定了基础.     

海洋链霉菌差向异构结构域基因的克隆与分析

为研究差向异构结构域基因的序列特征以及其在非核糖多肽生物合成中的立体异构化特性,以海洋链霉菌 Streptomyces sp. X66基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得目的基因序列,经测序及生物信息学分析表明,该基因序列长 1 099 bp,Blast序列比对该基因与Streptomyces albidoflavus strain W68的E结构域基因序列相似度达99.45%,具有典型的差向异构结构域的功能区域,且包含差向异构结构域独有的保守基序HHxxxD,证明扩增的基因片段为差向异构结构域基因序列。理化分析显示：其拟编码366个氨基酸,理论等电点为5.69,原子组成为C1752H2738N510O523S3,不稳定指数为32.68,平均亲水系数为-0.15,编码产物为酸性亲水稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 ku,与预期相符。通过对差向异构结构域基因的研究,以期为进一步解析差向异构结构域功能及新型非核糖体多肽的研发提供科学依据。     

链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的克隆及生物信息学分析

本研究获得了海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因,并对其进行生物信息学分析。利用依据同源序列设计的兼并引物,对提取的链霉菌MY0504的基因组DNA进行PCR扩增,将得到的DNA片段连接到pMD18-T载体后转化感受态Trans10细胞,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析。最终克隆了1083bp的海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因。将获得的YG4基因输入Gen Bank网站,进行检索比对,结果显示与丝氨酸蛋白酶基因碱基序列同源性100%。对16s rDNA序列分析结果表明,该菌株与达格斯地链霉菌、氢化链霉菌、嫩白黄链霉菌、浅紫链霉菌的亲缘关系较近;通过对YG4基因编码蛋白的一级结构、二级结构、亚细胞定位和三级结构的预测和分析,结果表明:该基因编码360个氨基酸,其编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α螺旋和β折叠为主,无信号肽和跨膜结构域,有40个磷酸化位点;高级结构以无规则卷曲为主。本研究结果为研究海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了重要信息。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

甜荞苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,首次从甜荞(Fagopyrum esculentum)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的cDNA ORF序列,命名为FePAL。该序列长2169bp,编码722个氨基酸,与其他植物PAL基因同源性较高,为80%～97%,其推导的氨基酸序列含有PAL酶活性中心特征序列GTITASGDLVPLSYIA和多个脱氨基、催化活性位点。系统发育树表明,甜荞PAL基因与苦荞PAL基因聚类关系最近。     

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR (GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明：FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。     

迟钝爱德华氏菌FimA基因的克隆及序列分析

以迟钝爱德华氏菌Et、XA、EA分离株的DNA为模板,采用PCR技术,扩增菌毛亚基(FimA)基因的DNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:Et、XA、EAFimA基因由534个核苷酸组成,编码177个氨基酸。Et、XA、EA之间FimA基因核苷酸同源性为99%,与其它分离物核苷酸同源性为76%～77%,氨基酸同源性为81%～82%。     

脂肪酸Bacillus pumilus羟基化调控基因fadD-like的克隆与序列分析

利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的ω-1-羟基脂肪酸高产突变菌株M-F641、M-F81、M-F8272及B.pumilus20075的总DNA为模板,通过Primer Premier5.0软件设计引物,对决定长链脂肪酸无效降解途径中的关键酶基因fadD-like基因进行克隆,得到4条长约1 720 bp的fadD-like基因全序列;利用MEGA3.1、DNAStar等软件进行序列分析结合脂酰辅酶A合成酶系统进化分析,结果表明其与fadD基因具有较高的相似性,克隆得到的核苷酸为编码脂酰辅酶A合成酶的fadD基因序列;研究结果为长链脂肪酸高效转化生产ω-1-羟基脂肪酸提供基础。