金褐霉素高产相关基因的筛选与表达

通过高效表达金褐霉素生物合成基因簇中的调控基因来提高其产量。本实验从野生金褐链霉菌SYAU0709克隆aurJ3M基因,连接载体pMD19-T并测序。将带有aurJ3M基因的表达质粒pBJAUM转化金褐链霉菌SYAU0709,高效表达aurJ3M基因,获得重组菌株。通过高效液相色谱分析检测,重组菌株的金褐霉素产量提高约6 倍,并且遗传性能稳定,发酵结果说明过量表达aurJ3M基因能够提高金褐霉素的产量。     

链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的克隆及生物信息学分析

本研究获得了海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因,并对其进行生物信息学分析。利用依据同源序列设计的兼并引物,对提取的链霉菌MY0504的基因组DNA进行PCR扩增,将得到的DNA片段连接到pMD18-T载体后转化感受态Trans10细胞,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析。最终克隆了1083bp的海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因。将获得的YG4基因输入Gen Bank网站,进行检索比对,结果显示与丝氨酸蛋白酶基因碱基序列同源性100%。对16s rDNA序列分析结果表明,该菌株与达格斯地链霉菌、氢化链霉菌、嫩白黄链霉菌、浅紫链霉菌的亲缘关系较近;通过对YG4基因编码蛋白的一级结构、二级结构、亚细胞定位和三级结构的预测和分析,结果表明:该基因编码360个氨基酸,其编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α螺旋和β折叠为主,无信号肽和跨膜结构域,有40个磷酸化位点;高级结构以无规则卷曲为主。本研究结果为研究海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了重要信息。     

吸水链霉菌valG基因的克隆与表达

为提高井冈霉素A的产量,本实验尝试构建吸水链霉菌的多拷贝基因菌株.根据吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis）的糖基转移酶基因（valG）序列设计了1对引物.PCR扩增编码糖基转移酶（ValG）的1269 bp基因后,利用TA克隆构建克隆质粒pMD-19-valG.测序正确后经双酶切构建穿梭质粒pIJ8630-valG.再次测序验证后,经质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞将pIJ8630-valG导入吸水链霉菌中.PCR检测证实重组菌构建成功.HPLC检测发酵产物,发现井冈霉素A的产量达到了1.17 mg/mL,比出发菌株提高了11.2％,valG基因得到表达,为进一步利用valG构建新的高产菌株奠定了基础.     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

金褐霉素高产菌株的选育及发酵条件的优化

采用单因素分析方法找到金褐链霉菌较适合的发酵培养基:玉米淀粉和葡萄糖为主要碳源,黄豆粉和酵母粉为混合氮源.较优的发酵条件为:接种体积分数为10%、pH 7.5、装液体积分数为20%、种龄为40 h、转速为220 r/min、发酵时间为66 h,其产素单位达到2 897.41 μg/mL.金褐链霉菌原始菌株经紫外诱变,照射时间30 s的金褐霉素产量最高.     

1株具有高产木二糖的产木聚糖酶马特链霉菌的鉴定

对1株具有高产木二糖的产木聚糖酶马特链霉菌进行了鉴定。从土壤中新分离得到1株具有产木聚糖酶活性的链霉菌sp.67,对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等方面的鉴定。PCR扩增得到其16s rDNA序列为1481 bp,通过在NCBI上BLAST比对,并运用ClustalX 1.8和MEGA 3.1软件绘制系统发育树,分析结果表明,sp.67与S.matensis AB 184221菌株同源性为99.52%。结合与生理生化实验结果一致,初步鉴定sp.67为马特链霉菌(Streptomyces matensis)。该菌株所产木聚糖酶水解碱处理棉籽饼的主要产物为木二糖,在生产高纯度木二糖中具有潜在的应用价值。     

烟草白粉病抗性基因型的多重PCR检测体系及其在回交育种中的应用

为提高烟草白粉病隐性抗病基因（感病基因）NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）在分子标记辅助选择育种中基因型的选择效率,根据已报道的M1和M2突变基因序列,设计4对单基因特异性引物,组成2个双重PCR反应体系,分别用于同时扩增M1和M2突变型或M1和M2野生型等位基因。结果表明,建立的2个双重PCR体系扩增的特异性片段与单重PCR体系扩增的片段完全吻合,突变基因纯合体只在突变基因多重PCR体系中产生191和306 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生基因多重PCR体系中产生437和652 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系可经过1次或2次PCR扩增准确检测出回交转育过程中回交或自交后代M1和M2的基因型,加快抗病品种育种进程。      

核心链霉亲和素的原核表达

以链霉菌(Streptomyces avidinii)的基因组为模板通过PCR 扩增得到354bp 的核心链霉亲和素基因Stv13,并将其与pET22b+、pGEX-4T-1 连接构建大肠杆菌表达载体,与P43 连接构建枯草芽孢杆菌分泌型表达载体。大肠杆菌表达的核心链霉亲和素Stv13 大部分以包涵体的形式存在,而枯草芽孢杆菌则无核心链霉亲和素Stv13分泌表达。     

传统霉菌发酵食品中的霉菌DNA扩增

为了解市场上霉菌发酵食品能否扩增霉菌DNA,除了红曲霉外其他曲霉是否具有pksCT基因,以及加热灭菌条件对红曲黄酒中pksCT基因降解的影响。从市售的11种食品中提取DNA,选用ITS基因引物和pksCT基因引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,并电泳分析。分别用麦曲、红曲发酵黄酒,对发酵前、发酵中、灭菌后、贮藏期样品扩增pksCT基因并测定橘霉素质量浓度;选择灭菌温度70、80、90、100℃,灭菌时间10、20、30 min,灭菌后样品扩增pksCT基因。结果表明有4种食品能用ITS引物扩增出条带,但只有红曲霉发酵的红腐乳能扩增出pksCT基因。红曲黄酒在发酵中、灭菌后能够扩增出pksCT基因,并且在80℃灭菌20 min和90℃灭菌10 min条件下,仍然可以扩增出pksCT基因,但90℃灭菌20 min或100℃灭菌10 min,DNA受到破坏。红曲霉发酵食品能够扩增出pksCT基因,曲霉发酵的食品未能用pksCT基因引物扩增出条带。通过PCR方法扩增出部分霉菌发酵食品的霉菌DNA并测序,有助于了解其加工中使用的菌种,继而为发酵加工食品的终端监测提供一种新方法。     

山西太子滩温泉土壤放线菌多样性及功能基因筛选的研究

收集太子滩温泉周围的4份土壤样品,用6种分离培养基对土壤中的细菌进行分离,再通过分析16S rRNA基因序列对分离菌株进行初步分类鉴定。采用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳检测放线菌是否具有抗生素生物合成基因NRPS、PKS I、PKS II。从4个土壤样品中共分离出104株放线菌,主要分布于放线菌域的3目5科12属,包括链霉菌属（Streptomyces）、微杆菌属（Microbacterium）、壤霉菌属（Agromyces）等;菌株M6W4-7-2与发表菌株Streptomyces ruber NRRC 14600T的16S rRNA基因序列相似性为98.58%,可能为链霉菌科链霉菌属的潜在新种。太子滩温泉附近土壤有着丰厚的放线菌资源,且放线菌的抗生素合成基因的阳性率较高,具备从中发现放线菌新物种及新抗生素的潜力。     

PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因

根据编码绿脓杆菌外毒素A基因设计引物,应用PCR技术检测绿脓杆菌外毒素A基因。从绿脓杆菌中扩增出402bp外毒素A基因。测序结果表明,与已发表序列同源性为100%。PCR敏感度试验表明,可检测到含量为3cfu/mL的绿脓杆菌。从绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳酸菌菌液中特异性地检出编码绿脓杆菌外毒素A基因。该技术具有简易、敏感、快速和特异性强等特点,可用于食品和细菌感染的绿脓杆菌菌株的鉴定。     

PCR法检测肉鸭屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染

为建立肉鸭加工中快速、准确的沙门氏菌PCR 检测方法,并应用于肉鸭屠宰生产加工链沙门氏菌的实时监测。采用Primer Premier 5.0 软件针对沙门氏菌特有的fimY 基因设计合成一对引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′,并对沙门氏菌DNA 扩增PCR 体系的退火温度、引物浓度、Mg2+ 浓度和聚合酶浓度进行优化。结果表明：成功扩增出沙门氏菌标准株和分离株的2 7 5b p 目的片段,灵敏度达到了1.2pg;应用建立的PCR 方法对国内某典型肉鸭屠宰厂的肉鸭屠宰链环节进行沙门氏菌污染的检测,发现在屠宰环境、拔毛浸烫水、浸蜡冷却水、清洗池水、宰前毛、食道、粪便和沥水体腔内共有25 个样品中扩增出了275bp大小的特异性片段,而空白对照无扩增条带。     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

植物乳杆菌P8亚油酸异构酶基因及其上游非编码区的克隆与分析

依据GenBank中已公布的亚油酸异构酶基因,设计一对特异性引物,PCR扩增该基因后,克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定和序列分析表明,亚油酸异构酶基因大小为1720bp。该基因与植物乳杆菌AS1.555(DQ227322)的同源性达到99%,与泡菜植物乳杆菌(DQ010331)的同源性达到89%。该基因序列在GenBank上注册,编号为HM569265,对其进行生物信息学分析发现,基因中含有一段低复杂性区域。分析乳酸杆菌(CP001617)基因组全序列,设计了亚油酸异构酶基因上游非编码区805bp片段的特异性引物,PCR扩增该片段后将其克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后,进行序列分析和生物信息学的初步分析,预测出该片段中有12个基序,以及6个转录调控元件。     

玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及原核表达

从玉米嫩叶中提取总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)全长基因,回收目的片段并测序,该基因编码区全长1605bp,编码535个氨基酸残基,分子量为60.9kD,与GenBank(登录号：AJ421525)上已发表的序列同源性为100%。按正确的阅读框架将玉米TGase基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,1mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,经凝胶分析软件测得蛋白表达量约占总蛋白的15%,以His-Tag抗体作为一抗,采用Western-blot方法检测目的蛋白,结果证明所表达的特异蛋白是带有His-Tag的重组融合蛋白,利用Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,测得纯化后的TGase酶活力达到16U/mg。     

Comparative sequence analysis of spa gene of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis: characterization of an unusual spa gene variant

The protein A encoding gene spa of four Staphylococcus aureus strains isolated from bovine clinical mastitis was amplified by PCR and sequenced. The four strains were selected after an initial screening of spa gene of 41 strains isolated from mastitic cows and were subjected to detailed investigations. According to the sequencing results the spa gene of three strains (M1, M2, M3) appeared with gene segments encoding five (E, D, A, B and C) and four (E, A, B and C) IgG binding domains for two (M1, M3) and one (M2) strain, respectively and with gene segments encoding four, two and two repeats of the octapeptide Xr-repeats for the strains M1, M2 and M3, respectively. For the remaining Staph. aureus strain (M4) gene segments encoding IgG binding domains E, D and A and a new domain BC with a size of 219 bp could be observed. The BC domain appears, with a deletion of a 123 bp segment from the border region between both domains, as fused domain of both previously characterized domains. The Xr-region of this strain had 11 octapeptide repeats.     

红曲霉中PKS基因的结构分析

对实验室保藏的一株高产Monacolin K红曲霉菌株及其野生株进行了初步的PKS基因结构分析。扩增得到红曲霉野生株W菌及其诱变株M菌的目的基因序列,并将测序产物和cDNA序列进行比对,确定该段基因序列不含内含子,且诱变株M菌的突变位置不在此段基因上。分别用ProfileScan、SWISS-MODEL预测了该段蛋白的结构域以及三维结构。