嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质的研究

为优化CEP的分离纯化方法,采用聚乙二醇(PEG)-20000浓缩粗酶液,用超滤离心管过滤酶液,40%~60%硫酸铵盐析分级沉淀,Sephacryl-S-300HR纯化,并通过Native-PAGE切胶回收得到纯酶。所得CEP的分子质量为28.3ku,比酶活力62.066U/mg,最适温度32℃,最适pH6.5,耐热性比较强,耐酸性明显好于耐碱性。Co2+、Mg2+、Ca2+对CEP有激活作用;Ba2+、Mn2+、K+、Na+对CEP的活力影响不大;Zn2+、Ni2+则表现出较强的抑制CEP活性作用;EDTA对CEP活性有抑制作用,表明CEP是一种金属离子激活酶;PMSF对CEP有显著抑制作用,表明CEP是一种丝氨酸蛋白酶。用嗜酸乳杆菌CEP水解乳清蛋白,其酶解液对ACE的抑制率为56.31%,表明CEP水解乳清蛋白可以产生ACE抑制肽。     

乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶的分离纯化

本研究确定了分离纯化乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶(CEP)的最佳技术路线.用裂解液(50mmol/L Tris-HCI,2mmol/L EDTA-Na2,100mmol/L NaCl,0.5%Tritonx-100,1mg/ml溶菌酶,pH8.5)悬浮菌体(20ml/g),37℃下保温3h,离心后取上清液即为粗酶液.粗酶液通过45%硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadcx A-25和Sephacryl-S-300 HR两步层析,可以得到纯化的细胞壁蛋白酶.蛋白酶提纯倍数达到74.048%,最后回收率为14.865%,PAGE电泳检测为一条带,SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构,分子量大约为53kD.用纯化后CEP酶解乳清蛋白,酶解液ACE抑制率为45%.     

巴西松子中蛋白酶的分离纯化及酶学性质

在单因素试验基础上,通过正交试验研究pH值、提取时间和料液比3个因素对巴西松子中蛋白酶活力的影响,得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取缓冲液为pH9.0的硼酸-硼砂缓冲液、提取时间为60min、料液比为1:8(m/V);采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化巴西松子中的一种蛋白酶,结果表明:纯化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍,回收率为21.65%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明:该蛋白酶分子质量为33kD。酶学性质结果表明:该蛋白酶最适pH值为9.0,属碱性蛋白酶;反应的最适温度为50℃;金属离子Mn2+对该蛋白酶活性有强烈的激活作用,而Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用。     

荧光假单胞菌胞外蛋白酶的纯化及特性研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析方法对从原料乳中分离出一株荧光假单胞菌胞外耐热蛋白酶进行纯化及特性研究。将纯化后的单一蛋白酶进行SDS-PAGE分子质量测定,并考察最适温度、最适pH值、热稳定性、金属离子对其酶活性的影响及对该蛋白酶的氨基酸种类分析。纯化后蛋白酶的分子质量为47kD,经纯化后蛋白酶比活力提高了近61.38倍;最适温度和pH值分别为30℃和7.0;二硫苏糖醇对蛋白酶活性具有一定的抑制作用,Fe2+可以促进蛋白酶活性的提高;该酶具有较强耐热性,原酶液经130℃热处理3min后,残留酶活仍超过原酶液的47.67%;该蛋白酶氨基酸组成中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)的含量占明显优势,其中Gly含量最高,物质的量分数高达42%。     

干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

地衣芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化和性质研究

用地衣芽孢杆菌发酵液制备弹性蛋白酶粗酶液,采用硫酸铵分级沉淀和Sephadex凝胶柱层析的方法分离纯化弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的酶学性质进行研究。结果表明：弹性蛋白酶粗酶液经40%～70%饱和度的硫酸铵纯化后比活力提高到120U/mg,经凝胶柱层析纯化后比活力可达到292U/mg,纯化倍数为12.6,SDS-PAGE法证实弹性蛋白酶分子质量为29.5kD。对酶学性质的研究结果表明：弹性蛋白酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值为7.4,以刚果红-弹性蛋白为底物,米氏常数Km为9.67mg/mL。低浓度金属离子Ca2+和K+对酶活力有促进作用,而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+对酶活力则有抑制作用。     

干酪乳杆菌蛋白酶的分离与性质鉴定

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,Lc)6033经增菌培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液,并经70%～80%饱和度范围的硫酸铵分级沉淀初步提纯,酶活力回收率(OD275%)为9.71%;酶液最适pH值为6.5左右、最适温度为40℃,Co2+、Mn2+能显著增强酶液活力,Cu2+、Fe3+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶液有较强的抑制作用,而Zn2+、碘乙酸和β-巯基乙醇的抑制作用较轻微,可见酶液中可能含金属酶、丝氨酸酶及巯基酶等多种蛋白酶.     

嗜热芽孢杆菌HSO8耐热中性蛋白酶的分离纯化及部分特性研究

从高温土壤中分离出1株产耐热中性蛋白酶的嗜热芽孢杆菌,研究了该酶的分离纯化与生化特性.蛋白酶经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-100HR凝胶层析分离纯化后,纯化倍数提高4.25倍,产率5.1%;经SDS-PAGE电泳测得其分子质量为30.9 kDa.酶的最适温度与pH试验表明,其最适温度为65 ℃,最适pH为7.5,并在50 ℃时保持1 h以上的稳定.该蛋白酶活性受到EDTA的抑制,Zn2+能提高酶活性,该酶为金属蛋白酶.改性酪蛋白(Azocasein)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)等3种底物专一性试验表明,改性酪蛋白是其最适底物.     

乳酸菌基础培养基比较研究

研究了脱脂乳中性蛋白酶的最适酶解条件，并以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为混合发酵菌种，对MRS、脱脂乳和脱脂乳酶解液3种基础培养基进行了比较研究。结果表明：（1）脱脂乳中性蛋白酶的适宜酶解条件为：加酶量5000U／g蛋白质，在pH=7．0，50℃下酶解2h；（2）脱脂乳酶解液是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种较好的基础培养基，其冻干发酵剂的质量和数量均优于脱脂乳培养基。以脱脂乳酶解液为基础培养基制备的冻干发酵剂的活菌数达到3．5×10^11cfu／g，冻干发酵剂的重量是脱脂乳的1．93倍。     

地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究

就地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行了研究,以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标,对产酶条件进行优化,并研究了该酶的基本酶学特性;确定了培养基的最佳碳源为玉米粉.最佳氮源为黄豆饼粉,C/N在1:2～1:1范围时去酰胺度最高;最适摇瓶发酵条件为:种龄18h,接种量2%,装液量30mL/100mL,摇床转速140r/min,pH 7.0,35℃,发酵50h;碱性蛋白酶最适作用pH为10.0,最适反应温度为50℃,60℃保温2h后仅存5.9%的活力,在pH8～11之间有较高的pH稳定性.     

两种乳酸杆菌超声破碎提取亚油酸异构酶条件的研究

本文利用超声波对两种乳酸杆菌细胞进行破碎,以提取细胞中的亚油酸异构酶,并就超声波破碎条件对亚油酸异构酶释放的影响进行了研究。通过单因素试验和正交试验得出嗜酸乳杆菌的最佳超声破碎条件为:间歇破碎次数80次(每次破碎3s,中间间隔4s),破碎菌液体积50ml,菌悬液浓度20g/60ml,破碎时的抽提缓冲液最佳pH值4.0,NaCl浓度0.2mol/L;保加利亚乳杆菌的最佳超声破碎条件为:间歇破碎次数80次(每次破碎3s,中间间隔4s),破碎菌液体积60ml,菌悬液浓度15g/50ml,破碎时的抽提缓冲液最佳pH值4.8,NaCl浓度0.3mol/L。     

超声波-酶法制备紫甘薯营养液研究

以福薯13 为原料,研究超声波- 酶法制备紫甘薯营养液工艺条件。以紫甘薯营养液营养成分综合保全率为评价指标,通过正交试验和Box-Behnken 试验方法分别对超声波和酶解工艺进行参数优化。超声波处理工艺参数优化结果为超声波功率65W、温度50℃、时间25min、料液比1:70(g/mL),离心分离得到清液和沉淀物。以此沉淀物为处理对象进行酶解,优化得到酶解工艺参数为蛋白酶质量分数1 .5%、纤维素酶质量分数1 .5%、酶解pH4.3、酶解温度48℃、酶解时间65min、料液比1:16(g/mL)。离心分离后再次得到清液。将两次得到的清液混合则制得紫甘薯营养液,经测定其营养成分综合保全率为82.26%,即保存了新鲜紫甘薯中82.26% 的特征营养成分。     

从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化

建立适用于从毕赤酵母菌中提取外源重组蛋白的超声破碎方法。采用Western Blotting免疫印记技术检测从毕赤酵母菌中提取的外源人脂联素蛋白活性,并以外源人脂联素蛋白活性作为考察指标,采用单因素和L9(33)正交试验设计,对超声破碎条件进行优化。结果表明：在外源人脂联素蛋白活性最高的情况下,超声破碎条件为超声破碎功率450W、时间25min、时间间隔(工作时间:间歇时间)10:10(s/s),此时细胞破碎率为(67.8±2.1)%。若在超声破碎时添加1mmol/L PMSF,虽对细胞破碎率并无显著影响,但外源人脂联素蛋白活性将会明显增高。     

酵母细胞破碎条件优化及高肽酶菌株筛选

为构建酵母细胞总肽酶活力的测定方法。采用单因素试验和L9(34)正交试验设计,以反应体系中游离氨基酸总量为肽酶活力指标,对酵母细胞破碎条件进行优化。结果表明：最佳破壁条件为：蜗牛酶添加量10mg/mL、超声破碎功率500W、超声时间8min、超声时间间隔5s。在此条件下,对主要源于贵州特色发酵豆制品的61 株酵母菌进行总肽酶活力测定,获得产高肽酶酵母菌4 株,即WCF-5、XWF-1、XWF-7 和YZJ-4。     

结合预处理方法的酶法制备美藤果肽工艺的优化

以美藤果粕为原料,制备美藤果肽。通过对比多种预处理方式,筛选出可促进蛋白水解的预处理方法,在此基础上利用响应面实验优化美藤果肽的酶法制肽工艺,并分析此法制得的肽相对分子量。结果表明:碱性蛋白酶最适宜用于美藤果肽的制备,而添加0.15%~0.45%亚硫酸钠、表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)或采用不同频率的超声预处理,能使美藤果蛋白酶解效果提升10%~50%,其中40 Hz的超声预处理效果最佳。响应面实验优化得到的最佳工艺为:40 Hz 15 min超声处理美藤果粕,添加7600 U/g碱性蛋白酶,52℃下酶解6 h,美藤果蛋白水解度为18.21%,得到相对分子量小而集中的寡肽(<1000 Da占94.64%),其中分子量在180~500 Da范围的占过半比例。     

不同方法制备的葵花籽多肽酶解物对亚硝化反应的抑制作用

以葵花籽分离蛋白为原料,研究不同方法制备的葵花籽多肽(SSP)对亚硝化反应的抑制作用。结果表明,与无超声波协同的常规酶解方法相比,在超声波振荡功率120W、超声时间/间歇时间为3min/7min的条件下,用酸性蛋白酶水解葵花籽蛋白,分别可以提高水解度和多肽得率17.3%和16.2%。用此方法得到的酶解产物对亚硝化反应具有更强的抑制作用,对亚硝酸钠的最大清除率和对亚硝胺的最大阻断率分别达到84.5%和92.4%,其效果均优于VC和谷胱甘肽。     

超声波和微波技术在芝麻饼粕ACE抑制肽制备中的应用

为了探索超声波和微波技术在芝麻饼粕ACE抑制肽制备中的应用,分别以超声波和微波对芝麻饼粕预处理,超声波辅助酶解,研究了超声波功率、超声波时间、微波功率、微波时间和加酶量对ACE抑制率的影响。结果表明:超声波预处理功率为4 W/m L、预处理10 min、添加1 300 U/g碱性蛋白酶时得到的芝麻饼粕ACE抑制肽的IC50值为2.81 mg/m L。超声波辅助酶解过程中超声功率选择0.5 W/m L、添加1 700 U/g碱性蛋白酶、酶解15 min时得到的芝麻饼粕ACE抑制肽的IC50值为2.96 mg/m L。微波预处理功率为1.33W/m L、微波预处理5 min时得到的芝麻饼粕ACE抑制肽的IC50值为2.81 mg/m L。     

响应面法优化超声辅助酶法制备无骨鸡爪胶原蛋白肽

采用超声辅助酶解法从无骨鸡爪（鸡爪剔骨）中提取胶原蛋白肽,以胶原蛋白肽得率为指标,从五种商业用酶中（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶）筛选出碱性蛋白酶作为实验用酶,在此基础上以料液比、超声功率、超声时间和酶解时间四个因素进行单因素实验,选取影响酶解效果显著的三个因素,以胶原蛋白肽得率为响应值,采用响应面分析法进行三因素三水平试验。结果表明:各因素对得率的影响大小为料液比>酶解时间>超声功率,确定的最佳提取工艺为:料液比为1:26（g/mL）、超声波功率为250 W和酶解时间为4.0 h,最终胶原蛋白肽得率为49.24%±0.98%。在此工艺下得到的无骨鸡爪胶原蛋白肽的溶解度较好,在90%以上。可将其用于加工工业中,为扩大肉鸡副产物胶原蛋白的市场应用提供一定的理论支撑。     

碱法破壁-酶法提取葡萄酒废酵母细胞壁多糖的工艺研究

以工业发酵产生的葡萄酒废酵母泥为材料,过筛法除去葡萄果皮、果籽等杂质后,以细胞破壁液蛋白质含量、多糖提取率为评价指标,通过单因素试验和正交试验对碱法破壁-酶法提取细胞壁多糖工艺进行优化,以期提高多糖提取率。结果表明,最佳工艺条件为细胞破壁碱（KOH）处理温度为60 ℃,碱（KOH）质量浓度为70 g/L,处理时间为1.5 h,80 kHz超声辅助;酶法提取多糖最佳工艺为酶作用温度50 ℃,酶解时间1.5 h,中性蛋白酶添加量0.3%,初始pH值7.0。在此优化条件下,葡萄酒废酵母多糖提取率为21.08%。     

超声波辅助酶解法提取食用猪油工艺优化及胆固醇脱除

为开发猪油的提取新工艺,以猪脂肪组织为原料,采用超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取食用猪油。在单因素试验的基础上,以猪油的提取率为考察指标,采用正交试验方法研究蛋白酶添加量、酶解时间、超声波功率和超声时间对猪油提取率的影响,并通过吸附条件的优化,研究β-环糊精、羧甲基纤维素及马铃薯变性淀粉3 种吸附剂对猪油胆固醇的脱除效果。结果表明：各因素对猪油提取率的影响从大到小依次为蛋白酶添加量＞酶解时间＞超声波功率＞超声时间;超声波辅助酶解提取食用猪油的最优工艺为蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s,在此条件下,猪油的提取率为（95.14±1.65）%;3 种吸附剂对猪油胆固醇均具有明显的吸附效果,脱除能力依次为β-环糊精＞羧甲基纤维素＞马铃薯变性淀粉。