基于免疫磁珠快速分离金黄色葡萄球菌的研究

通过实验优化建立基于免疫磁分离技术对金黄色葡萄球菌的快速分离方法,为后续快速检测提供基础.利用金黄色葡萄球菌多抗制备的免疫磁珠对其捕获.结合平板菌落计数,考察包被磁珠时多抗加入量、免疫磁珠加入量及捕获时间等因素对捕获效率的影响.在单因素实验基础上进行正交实验,并对该方法的灵敏度、特异性及其在食品中的应用效果初步探索.结果表明,最佳捕获条件为抗体加入量30μL,免疫磁珠加入量80μL,捕获时间45min,在此条件下捕获效率均超过30％,该方法捕获限可达到101CFU/mL,特异性良好,并初步用于羊肉卷洗水中金黄色葡萄球菌的快速分离,捕获时间小于1h.免疫磁分离作为一种快速的分离筛选方法,可用于食源性金黄色葡萄球菌的快速分离.     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

基于免疫纳米磁珠对福氏志贺氏菌的快速富集研究

利用纳米磁珠的超顺磁性,结合传统平板计数的方法,通过捕获效率,研究免疫纳米磁珠制备过程中抗体加入量以及免疫纳米磁珠捕获目标细菌时的加入量,并利用免疫纳米磁珠对纯菌液以及羊肉洗水中100、101、102、103 CFU/mL的福氏志贺氏菌进行捕获.结果表明,志贺氏菌多克隆抗体(4～5mg/mL)结合1mL链酶亲和素纳米磁珠((180±20) nm,2mg/mL)的最佳量为70μL,免疫纳米磁珠捕获高浓度目标细菌(102 ～ 104 CFU/mL)时的最佳加入量为60μL.对于纯菌液和羊肉洗水,其捕获限可分别达到100CFU/mL和101CFU/mL,并且捕获时间在1h之内.本研究优化了实验条件,为免疫磁珠快速富集目标菌提供了理论依据.     

免疫磁珠结合显色平板快速检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌

该研究利用羧基化磁珠偶联兔多克隆抗体,制备特异性免疫磁珠,并优化制备条件,然后与显色培养基联用,建立免疫磁珠-显色平板检测方法,用于富集分离婴儿奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明,磁珠与抗体的最佳偶联温度37℃、偶联时间2.0 h,1 mg磁珠的最佳抗体添加量为200μg,饱和偶联量为182.77μg。制得的免疫磁珠,捕获目标菌的浓度范围为10²～10⁷ CFU/mL,捕获率为68.4%～82.4%,与非目标菌反应率低于10%。检测方法应用于模拟污染样品,在目标菌浓度10²～10⁵ CFU/mL时,捕获率为66.2%～71.5%。相比传统方法,该方法的检测周期缩短了2～3 d。     

免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定牛奶、鸡蛋中的沙门氏菌

目的建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测牛奶、鸡蛋中沙门氏菌的方法。方法沙门氏菌经免疫磁珠特异性富集后采用MALDI-TOF MS鉴定,并优化富集过程中的抗体、免疫磁珠添加量以及捕获时间,研究其特异性,并用于实际样品中沙门氏菌的检测。结果富集过程最佳反应条件为:每1 mg磁珠中抗体添加量为250μg,1 mL菌样中免疫磁珠添加量为600μL,捕获时间为30 min,免疫磁珠捕获沙门氏菌具有特异性;用于检测牛奶和鸡蛋中的沙门氏菌时,将浓度为3 CFU/mL的沙门氏菌特异性富集后选择性增菌9h即可被MALDI-TOF MS准确鉴定。结论该方法具有选择性好,特异性高,耗时短,结果准确的优点,为食品中沙门氏菌的检测提供相关参考。     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

免疫磁珠技术分离检测熟制食品中的蜡样芽孢杆菌

目的 建立一种免疫磁珠技术分离富集熟制食品中的蜡样芽孢杆菌。方法 在一定量的蜡样芽孢杆菌体系中优化免疫磁珠与抗体用量以及最佳反应时间。在最佳实验条件下, 对免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的敏感性和特异性进行实验, 并对实际熟制食品的蜡样芽孢杆菌进行分离。结果 最终确定了蜡样芽孢杆菌抗体添加量50 μg/mL、免疫磁珠添加量100 μL, 免疫磁珠与菌液最佳作用时间为15 min, 当菌液稀释度达到10?7, 免疫磁珠法仍然可以检出, 相应的细菌数为4 CFU/mL。结论 本实验制备的免疫磁珠技术灵敏性高, 特异性好, 节省了检测时间和费用, 适用于食品中的蜡样芽孢杆菌的检测。     

基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化

本文研究了裸磁珠对金黄色葡萄球菌吸附效果,优化吸附条件,研究金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的吸附情况,最终将其应用于牛肉样品中金黄色葡萄球菌的检测。通过实验,优化裸磁珠吸附菌体的最小磁珠用量,最小吸附体积和最短吸附时间,并分析是否满足荧光PCR检测需要。结果表明:裸磁珠对浓度为102～107 cfu/mL金黄色葡萄球菌的吸附率在95%以上,有较好吸附效果;10 mg裸磁珠在5 mL菌液中吸附10 min,从磁珠上提取的DNA浓度和纯度可以满足荧光PCR的检测要求;裸磁珠在混合菌体中吸附到的金黄色葡萄球菌可以被荧光PCR检测出来,裸磁珠在牛肉样品中吸附浓度为102 cfu/mL金黄色葡萄球菌提取的DNA可以被荧光PCR检测出来。因此,裸磁珠可用于食品中金黄色葡萄球菌的富集,满足荧光PCR检测菌体量要求。     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。