环糊精促进Burkholderia cepacia转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3,6-二酮

Burkholderia cepacia可转化胆固醇生成甾体激素药物前体。通过质谱、红外光谱、核磁共振光谱等技术鉴定出一种有较高医药用价值的转化产物为胆甾-4-烯-3,6-二酮,但胆固醇的疏水性导致其转化得率较低。添加环糊精提高目标产物的转化得率,并考察环糊精对细胞生长及底物包埋情况的影响。分别选取多种环糊精(与胆固醇的摩尔比为1∶1)添加到转化体系,结果表明,甲基-β-环糊精和羟乙基-β-环糊精对提高胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率效果显著,分别是对照组的27.55倍和37.95倍。进一步优化羟乙基-β-环糊精的添加比例,当其添加量与底物胆固醇的摩尔比为2∶1时,产物胆甾-4-烯-3,6-二酮转化得率是摩尔比为1∶1时的1.59倍。红外光谱表征2 mol羟乙基-β-环糊精与1 mol底物胆固醇的包结络合情况,发现2 mol的羟乙基-β-环糊精可有效对胆固醇甾核的A环、侧链的26-C和27-C进行包被,形成稳定的包结物。羟乙基-β-环糊精可有效包被底物胆固醇,进而提高产物胆甾-4-烯-3,6-二酮的产率,为微生物转化生产胆甾-4-烯-3,6-二酮提供借鉴。     

胆固醇氧化酶发酵研究

对从土壤中筛选到的菌株ＤＧＣ－００７进行ＵＶ诱变,选育到菌株ＤＧＣ－０４８．对影响突变株产酶的条件进行了优化,初步确定了ＤＧＣ－０４８合适的产酶摇瓶培养基组成．在发酵温度为３０℃,培养基起始ｐＨ７．５～８．０的条件下,接种量１０％,发酵４８ｈ,产酶可达３５０μｍｏｌ／（ｍｉｎ·Ｌ）     

降解植物甾醇产雄甾1,4-二烯-3,17-二酮工程菌株的构建及转化培养基优化

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作为甾体激素药物不可替代的中间体,是多种激素类药物的原材料。在分枝杆菌(Mycobacterium sp.ZFZ)体内过表达3-甾酮-Δ¹脱氢酶(KstD),获得一株ADD生产菌,随后研究了不同培养基组成对该菌株生产ADD的影响。在单因素的基础上,以ADD产量为衡量指标,采用响应面法优化了转化培养基的组成,并建立各影响因素变化的二次回归方程。结果表明,最适宜的转化培养条件为玉米浆23 g/L、葡萄糖9 g/L、硝酸钠2.8 g/L、磷酸氢二钾2 g/L。此条件下底物甾醇浓度为10 g/L时,ADD的产量可达(4.12±0.18) g/L,ADD产量比出发菌株提高了近18倍。     

菌株Bacillus sp ST06-95转化植物甾醇为雄甾烯酮发酵条件的优化

利用本研究室筛选获得的Bacillus sp ST06-95为出发菌株,对植物甾醇进行选择性侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）。对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化。结果表明,用0.4%的Tween80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳。最佳发酵条件为:初始pH7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间160h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1∶4。在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约为4∶1。      

雄甾烯酮转化菌的诱变育种和发酵条件优化

采用紫外线照射和NTG对实验室保存的一株对植物甾醇有降解能力的Mycobacterium sp. SH5进行诱变处理,得到一株雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-end- 3,17-dione, AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst -1,4-end-3,17-dione, ADD)分解酶 (9α-羟化酶) 缺陷型菌株Mycobacterium sp. SH5-52.对Mycobacterium sp. SH5-52降解植物甾醇侧链得到AD (D) 的培养基组成、接种量、温度、pH值和溶氧等发酵条件进行了研究.在最佳的发酵条件下,投料质量浓度为0.6 g/dL时,AD (D) 的转化率由原来的37.2%提高到47.6%左右.     

菌株Bacillus sp ST06-95转化植物甾醇为雄甾烯酮发酵条件的优化

利用本研究室筛选获得的Bacillus sp ST06-95为出发菌株,对植物甾醇进行选择性侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮 (AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD).对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化.结果表明,用0.4%的Tween80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳.最佳发酵条件为:初始pH7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间160h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1∶ 4.在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约为4∶ 1.     

胆固醇诱导甾短杆菌发酵产胆固醇氧化酶能力的研究

利用胆固醇诱导甾短杆菌发酵来提高胆固醇氧化酶产量;通过对单因素的研究,选取影响比较显著的3个因素:胆固醇质量浓度、吐温-80添加量、超声波功率,并利用Box-Behnken试验设计和响应曲面分析法进一步研究得到结果:甾短杆菌产酶的最佳条件是当超声时间为20min时,胆固醇质量浓度为3.30g/L、吐温-80添加量为3.72mL/L、超声波功率为80W,在此条件下测得的胆固醇氧化酶产量为731.967U/L。比未使用胆固醇诱导产酶时,酶产量提高了1.17倍。     

转化植物甾醇产22-羟基-23, 24-双降甾-1, 4-二烯-3-酮(HPD)工程菌株的构建及发酵培养基优化

22-羟基-23, 24-双降甾-1, 4-二烯-3-酮（HPD）作为一种重要的甾体药物中间体,是合成很多皮脂类药物的原材料。通过在分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum DSM 1381）体内过表达3-甾酮-Δ1脱氢酶（KstD）基因,Mycobacterium neoaurum DSM 1381Z菌株发酵液中HPD的产量由71%提高到84%。在单因素选择的基础上,以产物HPD的产量作为衡量指标,利用响应面方法优化发酵培养基,建立各个因素之间变化的二次回归方程。结果表明,最合适的发酵培养基组成条件是玉米浆9 g/L、硝酸钠1.8 g/L、葡萄糖6 g/L、磷酸氢二钾2 g/L。此条件下5 g/L的植物甾醇,HPD的产量可达3.73 g/L,HPD的产量比原始菌株提高了大约2.7倍,具备潜在的工业化应用价值。     

Nocardia canicruria BF313催化甾体9α-羟基化发酵工艺优化

应用微生物转化的方法,以Nocardia canicruria BF313作为实验菌株,雄烯二酮为底物,研究了生物法制备9α-羟基雄烯二酮的新工艺。实验考察了转化培养基成分、投料方式、初始pH等因素对微生物转化生成9α-羟基雄烯二酮的影响。最终确定的发酵培养基为:15g/L葡萄糖,2g/L蛋白胨,5g/L酵母粉,1.5g/L硫酸亚铁。灭菌前调pH为7.0,以4%的接种量接种,预培养16h后以拟结晶方式投加底物,经过48h的转化,在投料浓度为10g/L情况下,底物转化率可高达97.2%,在投料浓度20g/L情况下,底物转化率也可达82.7%,投料浓度高于国际水平10g/L,具有极好的产业化前景。     

3-羟基丁酮的研究概况及进展

本文简述了3-羟基丁酮的性质以及生产应用方面的研究进展，并对化学合成法与生物发酵法生产3-羟基丁酮的工艺方法进行了比较。     

从乳化体系中分离纯化短杆菌产胆固醇氧化酶

添加剂W对酶的分离纯化造成很大困难,用异丙醇沉淀发酵液的同时加入(NH4)2SO4能够有效地破除乳化体系,去除添加剂W,酶收率达到90%.在pH值为8.0的条件下用SepharoseDEAEFastFlow离子交换透析酶液,比酶活从3.21U/mg提高到29.21U/mg,酶收率达70.1%.     

Brevibacterium sp.DGCDC-82发酵罐中生产胆固醇氧化酶

用Brevibacterium sp.DGCDC-82在7L发酵罐中分批培养.分别对添加剂吐温-80、培养温度、培养基的pH、通风量和搅拌速度在胆固醇氧化酶的生产中的影响进行了研究.结果显示以上条件均对产酶有影响.在不同的发酵阶段改变发酵操作条件,发酵20 h最高酶活可达1203U/L,生产强度可达60 U/(L·h).既有效地提高了胆固醇氧化酶的产量,又防止了发酵过程中的泡沫外溢.     

响应面分析应用于短杆菌产酶工艺的优化

本文研究了用响应面分析法(RSM)优化短杆菌产胆固醇氧化酶的工艺，发现胆固醇添加量及超声处理时间是影响短杆菌产酶最重要的因素。在模拟优化的条件下：胆固醇为4．076g／L，吐温-80为0．2932％(v／v)，照射时间为22．361min，COD最大产量1．483U／mL。     

胆固醇氧化酶高产菌类芽胞杆菌的诱变选育

由本实验室产胆固醇氧化酶的菌株类芽胞杆菌作为出发菌株,经过紫外＋LiCl、紫外＋光敏试剂（8-mop）物理化学诱变处理,最后得到一株突变株XUM-10,并对其进行发酵条件的优化,最终酶活为221．20U／L,其酶活为出发菌株的2.5倍。     

胆固醇氧化酶转化蛋黄胆固醇工艺的优化

研究了用响应面分析法(RSM)优化酶法转化蛋黄胆固醇的工艺,发现胆固醇氧化酶(COD)添加量及蛋黄粉的稀释率是影响蛋黄胆固醇转化率最重要的因素.在模拟优化的条件下反应时间为14.15h,蛋黄粉稀释率为3.54,COD为5.39U/g时,胆固醇转化率达85.61%.对氧化产物进行分析发现仅有单一产物胆甾烯酮,该产物具有降血脂、减肥等功效.     

胆固醇氧化酶的发酵条件及酶学性质研究

Brevibacterium sp．可以发酵生产胆固醇氧化酶,实验中对该菌种进行了底物诱导及发酵条件的优化, 确定其最适培养基为(%)：蔗糖0．3,酵母膏0．2,蛋白胨0．3,牛内膏0．3,K_2PO_4 0．1,MgSO_4 0．05,pH6．8。最适培养条件为：接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL 培养基/250mL 三角瓶,200r/min。在最适培养基及最适条件下,胆固醇氧化酶的酶活力可达到24．01U/mg,比未优化前1．71U/mg 提高了14倍。该酶具有较强的酸碱稳定性和热稳定性,最适 pH 为6．5,最适温度为54℃。在最适 pH 和温度条件下测得该酶 km 值为7．1 ×10~(-5)mol/L。     

短杆菌属产胆固醇氧化酶的发酵条件优化

短杆菌属(Brevibacterium sp.)是胆固醇氧化酶高产菌,对其进行底物诱导及发酵条件的优化,其最适培养基为蔗糖0.3%,酵母膏0.2%,蛋白胨0.3%,牛肉膏0.3%,K2HPO4 0.1%,MgSO4 0.05%,pH6.8。最适培养条件为接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL培养基/250mL三角瓶,200r/min。结果表明,胆固醇氧化酶的酶活力可达到2439U/L,比未优化前195U/L提高了12倍。在pH6.5和温度54℃条件下测得酶米氏常数Km值为7.1×10-5 mol/L。     

比色法测定胆固醇氧化酶酶活

根据实验结果和理论计算确定检测体系中胆固醇的质量浓度为 0 .3 87mg/mL ,表面活性剂的质量浓度为 0 .2 g/dL ,确定过氧化氢浓度与反应液吸光度之间的定量关系 .在此基础上 ,建立了比色法测定胆固醇氧化酶酶活的方法 .