人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的：构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法：将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进-步真空冷冻于燥,制备YB...     

人二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达

目的：构建含有人二型大麻素受体（CB2）基因的真核表达载体,并实现其在HEK293细胞的表达。方法：首先采用PCR方法从含有CB2基因的质粒pcDNA3.1（＋）-CB2中扩增获得人的CB2基因,再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将获得的pIRES2-EGFP-CB2重组子转染HEK293细胞,应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况,RT-PCR和报告基因检测CB2的表达情况。结果：酶切和测序结果验证真核表达载体pIRES2-EGFP-GB2构建成功。可在荧光显微镜下观察到转染HEK293细胞表达的绿色荧光;RT-PCR和双荧光素酶报告基因法检测证明CB2蛋白在真核细胞中成功表达;CB2受体激动剂JWH-015能显著逆转腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱发的荧光素酶活性增加。结论：成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-CB2,为进一步研究CB2基因的生理学和病理生理学功能及调控机制奠定了实验基础。     

RNAi沉默整合素连接激酶基因对人膀胱癌BIU-87细胞体内成瘤的影响

目的：研究RNAi沉默整合素连接激酶（integrin-linked kinase,ILK）基因对人膀胱癌BIU-87细胞裸鼠皮下成瘤的影响。方法：构建4条针对ILK基因的特异性miRNA干扰载体和1条阴性对照载体,并利用脂质体转染法将其转染BIU-87细胞,并筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果。将10只裸鼠随机分为2组,皮下分别接种转染组细胞和未转染组细胞,观察瘤体的生长情况,并于接种4周后处死裸鼠,测量其瘤体体积和重量,并将瘤体做HE染色,观察瘤体病理情况。结果：转染组细胞ILK的表达明显受到抑制,以miR-3组的抑制效率最高。裸鼠皮下成瘤实验检测发现：两组均有瘤体形成,未转染组较转染组瘤体生长快,未转染组体积平均为：289.56±36.49mm3,转染组为：56.67±4.32mm3。瘤体重量分别为：1.265±0.02 g和0.518±0.03g。转染组与未转染组相比差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：利用RNAi技术能有效抑制靶基因ILK的表达,从而降低膀胱癌细胞的体内的增殖能力。     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

人miR-34a靶基因的生物信息学分析及载体构建

目的对人miR-34a(hsa-miR-34a)下游靶基因进行预测,并构建含自噬相关基因靶结合序列的GFP报告基因载体。方法使用TargetScan Release 5.1和RNA22软件分析hsa-miR-34a可能的靶基因,并利用Gominer软件对靶基因功能进行分析。根据预测结果,合成含自噬相关基因hsa-miR-34a靶序列的寡核苷酸,以pEGFPC2为载体构建系列质粒,并检测各载体的真核表达情况。结果预测结果显示hsa-miR-34a共有2904个下游靶基因,功能涵盖生物过程、细胞组分、分子功能三大类,其中与自噬作用直接相关的靶基因有beclin 1和sestrin 2。构建含beclin 1和sestrin 2作用位点的GFP载体共5个,质粒转染Hela细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光。结论成功构建hsa-miR-34a下游自噬相关基因靶位点序列GFP报告基因载体,为进一步研究hsa-miR-34a对自噬的调控作用奠定基础。     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的实验研究

目的：观察慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法：转染组用慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白（Lentivirus-enhanced green fluorescent proteins,Lenti-EGFP）转染细胞,对照组则加入空白培养液,在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）及感染后不同时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率;RT-PCR检测EGFP mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞技术（Flow cytometer,FCM）检测病毒对细胞增殖和凋亡的影响。结果：Lenti-EGFP转染细胞后从48h开始可见绿色荧光,在MOI=500时,转染后第5天转染率可达51%;RT-PCR检测转染组有EGFP的mRNA表达;MTT结果显示在MOI为1~500时,漫病毒不影响细胞的增殖;在MOI=500时,FCM检测慢病毒载体对细胞凋亡无影响。结论：慢病毒载体可以在体外稳定有效转染兔角膜基质细胞且不影响细胞活性,是角膜基质细胞理想的基因转染载体。     

短发夹RNA沉默S100A4对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平以及增殖水平和凋亡率的变化。经过脂质体介导将S100A4shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养,裸鼠体内成瘤试验检测各组细胞增殖情况。结果经测序鉴定证实成功构建S100A4-shRNA表达载体。所构建的S100A4-shRNA表达载体能够有效抑制MCF-7细胞中S100A4的表达,并且可以显著降低MCF-7细胞增殖水平以及诱导细胞进入晚期凋亡;稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,而实验组裸鼠肿瘤体积和重量明显小于空白对照组和阴性对照组。结论S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平。     

带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

shRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3及Ⅰ型胶原表达的影响

目的：构建抑制瘢痕成纤维细胞（keloid fibrobtast,KFB）Smad3基因表达的shRNA真核表达载体一研究Smad3 shRNA对KFBSmad3及Ⅰ型胶原（typ e I collagen,COLIA2）表达的影响：方法：用前期实验筛选出的1对最有效SiRNA重组构建Smad3shRNA表达质粒;通过脂质体介导的方法,将Smad3shRNA转染剑KFB,用RTPCR及Western blot的方法检测Smad3、COLIA2在不同时间点（0d至9d）表达的变化。结果：①重组质粒经酶切鉴定和测序、RT-PCR和westerll blot的结果均证实Smad3shRNA载体构建成功。②转染Smad3shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA蛋白表达都显著减低,到72h作用最强：光密度分析与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。COLIA2的mRNA与蛋白表达都明硅下降（P〈0．05）．结论：体外构建的shRNA-Smad3RNAi真核表达载体能显著抑制KFBSmad3的表达。并使其Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平表达出现相同的变化,提示Smad3 shRNA可能是改善皮肤创而愈合和抑制瘢痕增生一个新的治疗方向。     

乳腺癌细胞exosomes对人脐静脉内皮作用的实验研究

目的:观察人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞源exosomes对人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)增殖、迁移能力及血管样结构形成的影响.方法:超速离心及密度梯度离心法提取exosomes;MTT法检测MDA-MB-231细胞源exosomes对HUVECs增殖的影响;Transwell小室法检测HUVECs与exo...     

甲型H1N1流感病毒HA基因进化与蛋白特征分析

目的：通过对甲型H1N1流感病毒的HA基因序列进行分析,揭示其基因的变异性与本次疫病流行的内在因素的关系。方法：运用DNAStar、DNAMAN、Modeller 9V6和在线分析软件等生物信息学手段对HA基因和蛋白进行比较分析。结果：甲型H1N1流感毒株的HA基因来源于猪源谱系流感病毒,免疫压力比较小,基因重组融合了人流感病毒基因片段。甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位点氨基酸性质保守,碱性氨基酸不足,但潜在表位整体电势发生改变影响到抗体分子的识别和结合。HA蛋白多个抗原位点发生显著变化,并且有3糖基化位点就发生在抗原决定簇上;结论：HA基因重组导致HA蛋白变异致使抗原改变,造成人群普遍缺乏特异性免疫力,导致流感暴发与大规模流行。     

利用生物信息学方法挑选MCPH1基因标签单核苷酸多态性（tag-SNPs）位点

目的：为考察汉族人群MCPH1基因与原发性小头畸形病的关系,利用生物信息学方法挑选汉族人群中的MCPH1基因标签单核苷酸多态性（tag-SNPs）位点。方法：利用NCBI数据库,确定MCPHl基因研究范围：利用Hapmap数据库获取汉族人群的MCPHl基因SNPs数据;应用Haploview4.2对MCPH1基因进行连...     

EC9706细胞经不同剂量^137Csγ射线照射后拉曼光谱的研究

本文研究了EC9706细胞经不同剂量^137Csγ射线辐照、继续培养24h后的拉曼光谱,结果表明：（1）蛋白质酰胺Ⅲ带1240cm-1谱带在各剂量组出现不同程度蓝移,表明改变了β回折构象;色氨酸残基的吲哚环振动谱带550、762cm^-1谱带在各剂量组中出现较明显的频移,说明其内部构象的改变;空白对照组EC9706细胞中酪氨酸是“埋藏式”的,而在4、5、6Gy组却变成了“暴露式”的。（2）核酸中磷酸骨架基团的785、1096cm“在射线剂量组出现了明显频移和散射强度变化,这可能与”Cs7射线对EC9706细胞DNA损伤,导致其增殖机制变化有关。（3）脂类中的CH2、CH3弯曲振动谱带1448cm^-1仅在4,6Gy组出现频移,其它剂量组基本上没有改变。     

Hedgehog通路对乳腺癌细胞MDA—MB-231c—jun、uPA表达的影响和机制

目的：研究Hedgehog信号转导通路对人乳腺癌细胞MDA—MB-231c—jun、uPA表达的影响和作用机制,认识其在侵袭转移中的意义。方法：应用Hedgehog信号通路抑制剂Cyclopamine作用人乳腺癌细胞MDA—MB-231,Transwell小室进行侵袭迁移实验;Western blotting检测P—c...     

壬基酚对大鼠F1子代脑基因表达的影响

目的:研究壬基酚通过妊娠期暴露是否会影响F1子代的脑发育。方法:对SD孕鼠染毒NP,从妊娠第7天开始持续到产后第二天,分别提取NP组和对照组F1代2d龄大鼠的脑组织mRNA,表达谱基因芯片检测脑基因的表达。用Q-PCR法验证F1雄性子代大脑泛素特异性蛋白酶8、ATP结合盒转运子和内磺肽蛋白这三个下调基因的表达,然后用Western blotting法检测F1子代大脑泛素特异性蛋白酶8的蛋白表达。结果:ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette,ABCA)、内璜肽蛋白(Endosulfine alph,Ensa)、泛素特异性蛋白酶8(Ubiquitin Specific Protease 8,USP8/UBPy)基因和蛋白表达下调。结论:NP可影响神经细胞的正常结构和信号转导功能,并提示可以干扰机体内分泌系统、脂质和能量代谢及一系列正常生理功能。