里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的高表达

纤维二糖水解酶II(CBH II)是纤维素酶的重要组分之一,对纤维素酶的水解性能有着重大影响,而里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂中纤维二糖水解酶II明显不足,为了优化其酶系结构,采用了基因重组技术构建CBH II高产菌株:将里氏木霉CBH II基因置于里氏木霉强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。以里氏木霉ZU-02为宿主,采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入宿主分生孢子。以潮霉素B为抗性标记初筛到324个阳性转化子,进一步通过复筛,在以微晶纤维素为唯一碳源的筛选培养基上获得8个生长较快的优良转化子。在摇瓶条件下,分别对8个转化子进行产酶试验,培养48 h时,纤维二糖水解酶活力最高可达18.24 U·mL-1,是出发菌株的2.51倍。本结果对于里氏木霉纤维素酶的定向进化、提高其对纤维素的协同糖化效率具有重要意义。     

拟康氏木霉S—38中纤维素酶的动力学研究

采用动力学的方法研究了等温条件下PH值变化对拟康氏木霉中两个外切酶（CBHⅠ，CBHⅠ）和一个内切酶（EGⅠ）动力学参数的影响。结果表明，EGⅠ游离酶的pKe1及pKe2分别为4．4和5．7，EGⅠ酶—底物复合物的pKes1及pKes2分别为3．6和5．5；外切酶CBHⅠ的pKe1及pKe2分别为3．6和6．3，pKes1及pKes2分别为3．4和6．0；外切酶CBHⅡ的pKe1及pKe2分别为3．6和6．2，pKes1及pKes2分别为3．4和5．9。这些结果说明纤维素酶中存在两个羧基或一个羧基和一个咪唑基参与酶的催化反应，这种机制和溶菌醇是相似的。