AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌联合疫苗多糖含量免疫速率比浊检测方法的建立及验证

目的建立AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)联合疫苗(Men AC-Hib)多糖含量免疫速率比浊检测方法,并进行验证。方法采用免疫速率比浊法测定联合疫苗中A群、C群脑膜炎球菌及Hib多糖含量,绘制不同多糖抗原含量的标准曲线,并对方法的检测低限、精密度、准确度和特异性进行验证。结果 3种不同多糖抗原浓度在2~8μg/ml之间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.98;建立的方法检测A群、C群脑膜炎球菌和Hib多糖的检测低限分别为0.847、0.043和0.507μg/ml;检测各组分多糖抗原含量的批内和批间变异系数均小于5%,平均回收率在88.30~104.40%之间;各组分特异性多糖抗体仅与各自多糖抗原反应,且各组分多糖抗原共同存在时无相互干扰。结论成功建立了准确、特异的AC群脑膜炎球菌与Hib联合疫苗的多糖含量检测方法。     

13价肺炎球菌结合疫苗多糖含量速率比浊检测方法的建立及验证

目的建立速率比浊法检测13价肺炎球菌结合疫苗(13-valent pneumococcal conjugate vaccine,PCV13)中各型多糖含量,并进行验证及应用。方法对NaOH-柠檬酸解吸附方法进行优化及稳定性考察,并对建立的方法进行线性、特异性、精密度、准确度验证及应用。结果 NaOH与柠檬酸的最佳浓度均为0.3 mol/L,摩尔比为2∶1。在此条件下,各型多糖与磷酸铝佐剂得到最大程度的解吸附,且解吸附后的溶液较稳定,48 h内检测显示多糖含量基本无变化。方法的各项验证结果均符合常规质量控制要求;用不同来源的血清分别检测2个厂家来源的6批次PCV13的各型多糖含量结果差异均无统计学意义(P> 0.05)。结论建立的速率比浊法简便、快速,可准确检测PCV13中各型多糖含量。     

C群流行性脑膜炎球菌多糖分批发酵动力学模型的建立

目的建立C群流行性脑膜炎球菌多糖50 L罐分批发酵动力学模型,为实现对C群流行性脑膜炎球菌多糖发酵过程的工艺控制、优化及其放大提供理论依据。方法利用分批发酵的数据,以Logistic方程建立菌体生长动力学模型,以Leudedeking-Piret微分方程建立产物合成动力学模型,以底物消耗的物料平衡方程建立底物消耗的动力学模型,并应用Origin软件进行模型拟合,获得3个模型的参数。结果菌体的最大比生长速率(μmax)为0.731 2 h-1,最大菌体浓度(Xmax)为3.949 5 g/L,与菌体生长速率关联的产物合成常数(a)为0.004 97 g/(L·h),与菌体浓度关联的产物合成浓度(β)为0.015 44 g/(L·h),菌体对底物的得率(Yx)为1.905 2 g/g,产物对底物的得率(Yp)为0.130 1 g/g,菌体的维持因子(m)为1.070 1。结论建立的动力学模型能较好地反映C群流行性脑膜炎球菌多糖分批发酵过程中菌体生长、C群多糖合成和基质消耗的的变化规律。     

ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量火箭电泳检测方法的建立及其验证

目的建立ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量检测的火箭电泳法,并对该方法进行验证。方法分别用A、C、Y、W135群菌液免疫家兔,制备特异性抗血清,加至琼脂糖凝胶平板中,以定量的各群多糖原液作为抗原参考品进行火箭电泳,用已知的多糖浓度及对应的火箭峰高绘制标准曲线,得出直线回归方程,根据样品的火箭峰高计算多糖含量,确定该方法的检测限,并对该方法进行专属性、线性重复性、准确度、精密度验证;用建立的方法检测3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量。结果根据该方法绘制的标准曲线呈良好的线性关系,R2均≥0.95;该方法确定样品多糖浓度检测范围为3~7μg/ml,回收率在90%~110%范围内;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%;特异性好,未检出各群抗原之间的交叉反应。3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造与检定规程》的要求。结论建立的火箭电泳方法可用来检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量。     

冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中各群多糖含量检测方法的建立及验证

目的建立冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中多糖含量的测定方法。方法将10支ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗用注射用水复溶后,分为10份,70μl/份,依次加入20 mg/ml蛋白酶K溶液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μl,降解结合物中载体蛋白,采用火箭免疫电泳法进行多糖含量的测定,确定蛋白酶K最适加量。对建立的方法进行线性范围、定量限度确定以及准确度、精密性及专属性验证。结果 20 mg/ml蛋白酶K的最适加量为5μl;该方法的线性范围为2.5~40μg/ml,定量限度为2.5μg/ml;3个不同浓度的供试品重复测定3次,A、C、Y、W135群多糖含量的平均回收率分别为99.1%、96.5%、96.5%和97.4%;不同试验人员在不同时间对同一供试品重复测定9次,A、C、Y、W135群多糖含量的CV值分别为3.40%、4.11%、3.35%和4.88%;各群多糖抗原均与其对应的抗血清产生免疫沉淀,而与其他群抗血清不产生免疫沉淀,具有较强的特异性。结论建立了冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中多糖含量的检测方法,该方法在确定的限度范围内具有较好的准确度、精密性及专属性。     

脑膜炎球菌疫苗及相关问题探讨

<正>流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎奈瑟球菌引起的急性传染病,具有发病急、流行广、病死率高及菌群变迁和菌型漂移等特点,在大多数国家已经成为严重的公共卫生问题。接种脑膜炎球菌疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎和控制其流行的一种最有效的措施。目前,针对A、C、Y和W135群脑膜炎球菌均已开发出多糖疫苗和多糖结合疫苗,本文基于脑膜炎奈瑟球菌及其流行病学特点,主要介绍脑膜炎球菌疫苗的发展历程、各类脑膜炎球菌疫苗的现状和特点,及其疫苗使用的相关问题。     

A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量HPLC检测方法的验证及应用

目的验证A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量的检测方法。方法采用色谱柱XBridge Amide(4. 6 mm×150 cm,3. 5μm),流动相为乙腈、水、三乙胺(75∶25∶0. 1)的混合液,流速为1 mL/min,柱温为40℃,示差检测器温度为40℃,进样量为50μL。同时验证该方法的系统适用性、特异性、线性范围、精密度、稳定性、准确度及定量限。采用该方法对3个厂家生产的30批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量进行检测。结果乳糖对照品色谱峰的理论塔板数为8 123,与其他色谱峰的分离度> 1. 5;乳糖对照品及供试品溶液图谱于相应保留时间处可见乳糖峰,阴性对照溶液未见该色谱峰;乳糖浓度在0. 050 03～0. 650 4 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=3. 484 3×10⁵X-7. 378 4×10²,R²=0. 999 97。批号为Y201409089-1、Y201501002和201410050的3批供试品溶液分别测定6次结果的RSD分别为0. 71%、1. 01%和...     

A群脑膜炎球菌多糖菌苗免疫持久性观察

作者对10万余名15岁以下儿童进行了 A 群脑膜炎球菌多糖菌苗的免疫持久性观察。结果表明,接种后1周保护率为69.95%、2周为80.94%、1～4年>80%、5年为42.18%,免疫力可维持3～4年。114名儿童免后1周血清抗体上升4.77倍、2周上升6.26倍,抗体4倍增长率为67.54%,连续3年两组血清抗体 GMT 具有显著差别,与流行病学效果一致。     

A群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离糖含量测定方法的建立及其验证

目的建立A群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离糖含量测定的方法,并进行验证。方法采用脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,DOC)法,分别取1 ml 10、50、100、150、200、250、294μg/ml载体蛋白破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT),与100μl 1%DOC溶液(pH 7.3)混匀,离心收集上清,检测蛋白含量,确定DOC沉淀载体蛋白范围;用不同离子强度梯度的缓冲液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L氯化钠)稀释游离多糖与载体蛋白混合物溶液,收集上清,检测多糖含量,确定游离多糖分离条件;以1%DOC溶液作为稀释剂绘制参考品磷含量测定标准曲线,确定DOC存在对磷含量测定结果的影响,建立DOC沉淀蛋白结合磷含量测定方法测定A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离糖含量的方法,并对建立的方法进行精密度、准确性及重复性验证。结果 DOC沉淀载体蛋白浓度控制在250μg/ml以下;将0.8 mol/L氯化钠溶液作为A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离糖含量测定所需最佳稀释液;以1%DOC溶液作为稀释剂绘制的磷含量标准曲线线性范围在0~4μg/ml时,r2为0.999 9。A群脑膜炎球菌多糖结合物原液及游离糖对照品与载体蛋白混合物沉淀中蛋白回收率在95%~110%之间;游离糖添加试验回收率均在95%以上;4批A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物游离糖含量平均值均在规定范围内。结论建立的DOC沉淀蛋白结合磷含量测定方法可有效分离结合物与游离多糖,并准确测定结合物含量。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。     

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中A群游离多糖含量测定方法的建立

目的建立脑膜炎球菌结合疫苗中A群游离多糖含量的定量检测方法,并进行验证。方法采用高效阴离子色谱-电导法(high-performance anion-exchange chromatography with conductivity detection,HPAEC-CD),分析柱:IonPacTMAS11 Analytical(4 mm×250 mm),22 mmol/L Na OH流洗,流速为1 ml/min,25μl自动进样,电导检测。筛选样品的氧化反应最佳温度、双氧水浓度及干烤时间,确定HPAEC-CD的检测限和定量限,并进行专属性、准确性及精密度验证。应用建立的方法检测3批多糖蛋白结合物原液A-破伤风类毒素(A-tetanus toxoid,A-TT)多糖及游离多糖含量,并与《中国药典》三部(2010版)附录ⅦA磷测定法中的传统比色法进行比较;同时检测3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖及游离多糖含量。结果确定样品的氧化条件为:100μl/ml H2O2,220℃干烤90 min。磷标准品在0.1~1μg/ml范围内,峰面积和浓度线性关系良好(r=0.999 877);TT、C-TT、W-TT及Y-TT对测定无干扰;该方法的检测限为0.007μg/ml,定量限为0.024μg/ml;A群脑膜炎球菌多糖原液的加样回收率在97.56%~102.95%之间;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%。A-TT的多糖含量及游离多糖含量与传统比色法测定结果差异较小;3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖含量均符合《A、C群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》及《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》要求,游离多糖含量分别为24.31%、23.04%、24.44%和19.07%、17.80%、19.46%。结论采用H2O2氧化处理,HPAEC-CD检测,除了能对脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中微量A群多糖含量进行定量检测外,还能够进行游离多糖含量的检测。该方法灵敏度和精密度良好,操作简单、安全,对操作者及环境提供了保护。     

差异火箭免疫电泳定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖方法的建立及验证

目的建立差异火箭免疫电泳(differential rocket immunoelectrophoresis,DRIEP)定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖的方法,并对该方法进行验证。方法制备非均一性抗体琼脂糖凝胶,建立脑膜炎A群、C群、Y群、W135群游离多糖的DRIEP定量检测法,并对该方法的专属性、分离效果、线性、重复性及稳定性进行验证。分别采用DRIEP法及DOC沉淀化学法对11批各群脑膜炎球菌单价结合物进行检测。结果各群多糖抗原只与其相应特异性抗体发生结合,无交叉反应;各群结合物或混合物中的TT可完全与多糖分离;A群、W135群游离多糖定量对照品在2.5~20μg/ml范围内,C群、Y群游离多糖定量对照品在2~10μg/ml范围内,与沉淀峰高度呈良好线性关系,R2均>0.99;各群单价结合物的9次检测结果的CV值均<15%;多价脑膜炎球菌结合疫苗中各群游离多糖含量均比较接近。DRIEP法检测值较DOC沉淀化学法高约1/2倍,但两种方法检测结果的高低趋势具有相似性。结论DRIEP法可用于四价脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的定量检测,提高了该疫苗的质控水平。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测方法的建立

目的 建立A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量的HPLC检测方法,并对其进行验证。方法 采用HPLC法,色谱条件:色谱柱:TSKgel G3000SW(300 mm×7.5 mm,10μm);流动相:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液[pH(7.2±0.2)];流速:0.5 ml/min,自动进样100μl;检测波长:280 nm;柱温:室温。对该方法进行专属性、分离度、线性、精密性和准确性验证,确定该方法的定量限和检测限;应用建立的方法检测3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品中游离蛋白含量。结果 该方法检测游离蛋白的专属性、分离度良好;蛋白对照品在3~18μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R~2=0.998;3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品的加样回收率在82.9%~119.33%之间,RSD小于5%;确定方法检测限为1.0μg/ml,定量限为2.6μg/ml。3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品未检测出游离蛋白。结论 建立的HPLC法简便、灵敏、准确度高,可检测A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量。     

A群脑膜炎球菌荚膜多糖排溢法ELISA的建立及初步应用

目的建立A群脑膜炎球菌荚膜多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)排溢法ELISA,并进行验证及初步应用。方法采用改良过碘酸盐氧化法制备抗GAMP-HRP。以抗GAMP单克隆抗体包被酶标板,抗GAMP-HRP作为酶标抗体,建立检测GAMP的排溢法ELISA。采用棋盘滴定法确定包被抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,并对其特异性、敏感性及重复性进行验证。采用建立的排溢法ELISA检测GAMP-TT系列层析样品中的GAMP抗原活性,并与传统一步法ELISA及二步法ELISA进行比较。结果建立的排溢法ELISA的包被抗体最佳浓度为20μg/ml,酶标抗体最佳工作浓度为1∶128。该方法的特异性良好,敏感性与一步法和二步法相当,批内和批间变异系数与一步法相当;该方法检测GAMP-TT层析样品中的GAMP抗原活性的结果与二步法ELISA基本一致。结论排溢法ELISA的操作步骤与一步法ELISA大致相似,但较二步法ELISA显著简化,其对一步法ELISA中Hooks效应的纠正效果与二步法ELISA相同。     

用于ACYW 135群脑膜炎球菌多糖-CRM 197结合物分子量检测的SEC-RI-MALS联用方法的建立及验证

目的建立分子筛层析(size exclusion chromatography,SEC)-示差检测(refractive index,RI)-多角度激光光散射(multi-angle laser light scattering,MALS)联用方法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物的分子量,并对方法进行验证。方法首先单机测定ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中各血清群多糖-CRM97结合物的dn/dc值(折射率增量),再采用SEC-RI-MALS联用技术,以0.9%Na Cl为流动相,TSKgel G5000PWxl为色谱柱,在流速0.4 ml/min的条件下,对结合物的分子量进行测定。对方法的重复性和日间精密性进行验证,并通过对样品进行高温或冻融处理,分析SEC-RI-MALS法在监测分子量变化上的应用。结果各血清群多糖-CRM197结合物的高、中、低浓度样品平行测定3次重均分子量的相对标准偏差(RSD)均小于10%,不同浓度下测定的分子量大小无显著差异,其分子量分布曲线重合性好;连续5日检测各血清群多糖-CRM197结合物分子量的RSD值均小于10%,其分子量分布曲线重合性好。经沸水浴处理,各血清群多糖-CRM197结合物的分子量分布情况均发生了明显的变化;冻融处理对A、C群多糖-CRM197结合物的分子量无太明显的影响,W135和Y群多糖-CRM197结合物在冻融过程中出现了一定的分子聚集现象。结论建立的SEC-RI-MALS联用测定多糖-CRM197结合物分子量的方法具有良好的重复性和日间精密性,能够用于ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中结合物分子量的检测,并可对结合物在不同保存条件下的稳定性进行监测。     

肺炎球菌荚膜多糖去氧胆酸钠残留量测定方法的优化及验证

目的优化肺炎球菌荚膜多糖中去氧胆酸钠残留量的检测方法,并进行验证。方法采用《中国药典》三部(2010版)甲型肝炎灭活疫苗制造与检定规程附录Ⅰ中去氧胆酸钠残留量测定法,对肺炎球菌荚膜多糖原液中去氧胆酸钠残留量测定方法进行适用性确认;比较对照品在70℃水浴不同时间(20、40、60、120 min)及80℃水浴30 min的吸光度值,确定最佳反应温度及时间;验证优化后方法的线性、重复性及准确度。结果 2批肺炎球菌荚膜多糖原液70℃水浴20 min后检测去氧胆酸钠残留量,回收率在8.6%~240.8%之间,适用性不合格;优化后的反应条件为80℃水浴30 min。去氧胆酸钠浓度在10~80μg/ml范围内,与A值呈良好的线性关系,R20.99;3批去氧胆酸钠对照品溶液的重复性测定结果的CV值均小于8%;23种肺炎球菌荚膜多糖原液分别添加低、中、高浓度的去氧胆酸钠对照品溶液回收率在80%~120%之间。结论优化后的肺炎球菌荚膜多糖去氧胆酸钠残留量测定方法操作简单,线性好,结果准确,重复性好,可用于肺炎球菌荚膜多糖去氧胆酸钠残留量的检测。     

a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法的建立及验证

目的建立a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证。方法利用脱氧胆酸钠(Na DC)盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量。通过检测Na DC盐酸法沉淀破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、TT ADH衍生物(ADH derivative of TT,TTAH)及TT琥珀酰化衍生物(succinic anhydride derivative of TT,TTSA)的最大能力以及沉淀多糖降解物(depolymerized polysaccharide,de-PS)或降解多糖ADH衍生物(ADH derivative of de-PS,de-PS_(AH))与相应载体蛋白质混合物的最佳离子强度,并利用最佳离子强度检测混合物中多糖与蛋白质质量的最小比例,以确定Hia结合物游离多糖含量的测定条件。通过添加回收试验验证方法的准确度,多次测定结合物的游离多糖含量验证方法的精密度。结果 Na DC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响;Na DC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力分别为402.8、352.5和691.0μg/ml;在0.6 mol/L NaCl的离子强度下,Na DC盐酸法沉淀多糖与蛋白质混合物,当de-PS与TT或TTAH的质量比≥1∶2、dePS_(AH)与TT的质量比≥1∶4、de-PS_(AH)与TTSA的质量比≥1∶5时,多糖回收率均在95%以上。向结合物添加6、12、35和56μg/ml的de-PS或de-PS_(AH)时,多糖回收率均在80%~100%之间;游离多糖含量检测结果的CV值均在10%以内。结论建立的方法适用于不同结合方法制备的Hia结合物游离多糖含量的测定。