人巨细胞病毒培养条件的优化及快速病毒滴度检测方法的建立

目的优化人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的培养条件,并建立一种快速检测HCMV滴度的方法。方法以人胚肺二倍体细胞(MRC-5)为病毒传代和滴度测定用细胞,对病毒接种量、培养温度、保护剂种类等条件进行优化。将本实验室建立的快速微量中和试验-感染细胞核染色法用于病毒滴度检测,并与蚀斑形成法及微量细胞病变法进行比较,采用Behrens-Karher法计算病毒滴度。结果 HCMV接种MRC-5细胞后在37℃培养可出现明显病变;MOI为1.0时,病毒滴度基本达到平台;病毒收获时加入1%人血白蛋白或10%FBS保护剂可维持病毒滴度稳定。同一病毒液经蚀斑形成法检测病毒滴度为5.707 lg PFU/ml,微量细胞病变法和感染细胞核染色法检测病毒滴度分别为5.633和5.667 lg CCID50/ml,3种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。结论HCMV接种MRC-5的最佳培养条件为:病毒接种量1.0 MOI,在37℃培养,加入1%人血白蛋白或10%FBS作为保护剂。建立的感染细胞核染色法可用于HCMV滴度的快速测定,为抗病毒物质的开发及效果评价提供了一种新的技术手段。     

两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2BS细胞的敏感性

目的用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)(Oka株)毒种,比较两种方法制备的毒种对2BS细胞的感染复数及増殖动态差异。方法用现有方法(用含2%小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种)和新方法(用含90%小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种)制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1)感染第37代2BS细胞,观察细胞病变(CPE)情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2BS细胞感染的最适MOI。结果现有方法制备毒种以0.01~0.1 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001~0.01 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期。两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4~4.6 lg PFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8~4.0 lg PFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准。结论现有方法和新方法制备的毒种最适MOI分别为0.01~0.1和0.001~0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产。     

鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备

目的建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础。方法通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID5)0,并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性。结果NB324K细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48h及2h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48h收获,病毒滴度最高。制备的病毒液的平均滴度为8.69CCID50/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒的稳定性

目的观察人呼吸道合胞病毒(HRSV)在不同温度保存、冻融和超声波处理的稳定性。方法将HRSVA2株接种于KMB17细胞上适应培养后,收获病毒液,分别置于37、22、4和-20℃条件下保存不同时间,或经冻融和超声波处理后,用微量细胞病变法检测HRSV的感染性滴度,观察其稳定性。结果HRSV在37℃保存,病毒感染性滴度下降很快,第4天时,降至约1.50lgCCID50/ml,5d后降至1.00lgCCID50/ml以下,几乎检测不到;在22℃保存,病毒感染性滴度下降相对缓慢,第14天时比原始滴度降低约3.20lgCCID50/ml;在4℃和-20℃下保存较稳定,分别保存5周和3个月后,病毒感染性滴度下降<0.60lgCCID50/ml。冻融1、2、3次,病毒感染性滴度分别下降1.37、2.55和3.61lgCCID50/ml,冻融4次后,病毒几乎无感染性。超声波处理后,病毒感染性滴度下降很快,处理1次病毒滴度即下降至原始滴度的50%左右,处理2次后,病毒几乎无感染性。结论HRSV不宜在37℃和22℃存放,可短暂保存于4℃,在-20℃可保存较长时间;冻融和超声波处理均对病毒感染性滴度有明显影响。     

呼吸道合胞病毒空斑检测方法的建立及应用

目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)空斑检测方法,并用于病毒滴度的定量。方法将不同稀释度的RSVA2株病毒液分别接种于Hep-2细胞单层,加0.6%营养琼脂糖覆盖,培养6d后用10%甲醛固定。去除覆盖层,0.05%中性红染色,按文献报道的方法进行空斑计数。建立空斑法测定RSV滴度的标准曲线,并验证空斑法的准确性及精密性,应用建立的空斑法检测RSV感染BALB/c小鼠肺组织中的RSV滴度。结果RSVA2株感染的Hep-2细胞出现典型的空斑,直径约1～3mm,形态呈圆形或类圆形。空斑法的最低检测限为3.4×101PFU/ml,线性关系良好,相关系数r=0.999996,准确性及精密性均良好。RSV感染的BALB/c小鼠肺组织标本均出现数量不等的空斑。结论所建立的RSV空斑测定方法敏感、准确,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究RSV的感染性和免疫原性奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)中感染复数的分析

目的探讨水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)上的感染活性,确定感染复数(MOI)。方法使用100 ml小方瓶培养人二倍体细胞(2BS株),待长成致密单层后,接种病毒滴度为5.5 lgPFU/ml的水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株),每瓶接种量分别为0.02、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5和2 ml,于显微镜下连续观察细胞病变情况及病变比例,并连续记录收获时间;采用蚀斑法测定病毒滴度。结果当病毒接种量为0.02 ml时,细胞大部分生长正常,呈极性排列,无形态典型、广泛的病变,通过延长收获时间也无法获得形态典型、广泛的病变;当病毒接种量不低于0.1 ml时,呈典型、广泛的病变,随着病毒接种量的增加,收获时间逐渐缩短;仅病毒接种量为0.02 ml组细胞的病毒滴度低于3.7 lgPFU/ml;确定MOI在0.004 0~0.019 9之间,均可制备出质量稳定、符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求的毒种。结论确定了水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)感染人二倍体细胞(2BS株)合适的MOI,为水痘疫苗生产工艺的优化提供了参考依据。     

人呼吸道合胞病毒A_2株在不同细胞中的培养及其影响因素

目的在不同细胞中培养人呼吸道合胞病毒(HRSV),并分析其影响因素,为病毒的大量增殖创造条件。方法将HRSVA2株分别接种至人二倍体KMB17细胞、Vero细胞、人喉癌Hep-2细胞及HeLa细胞进行培养,采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度,并进行间接免疫荧光试验及合胞体观察。检测吸附时间、维持液pH值和培养温度对病毒增殖的影响。结果4种细胞中,Vero细胞对HRSV最敏感,病变早、病毒感染性滴度可达6.83lgCCID50/ml;KMB17细胞相对敏感性不高,但仍能良好增殖,病毒感染性滴度达6.13lgCCID50/ml;Hep-2细胞及HeLa细胞介于Vero细胞和KMB17细胞之间,病毒感染性滴度也达到6.83lgCCID50/ml。间接免疫荧光试验显示病毒在细胞浆内增殖。吸附时间对HRSV的增殖无明显影响;维持液的pH值对HRSV的增殖及病变特点均有一定的影响,在pH7.0～7.2时可快速引起细胞产生病变,并能达到最高感染性滴度;HRSV在37℃及32℃下培养均能良好地增殖。结论HRSVA2株在KMB17、Vero、Hep-2及HeLa细胞内均可增殖,但敏感性有一定差异,且对培养条件有一定的要求。     

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。     

鸡胚细胞培养狂犬病病毒工艺的优化

目的优化鸡胚细胞(chick embryo cells,CECs)培养狂犬病病毒(rabies virus,RV)的工艺。方法以M199为基础培养基,向其分别加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES缓冲液,并均加入碳酸氢钠,配制培养基M1、M2和M3。将驯化获得的CTNCEC25株按1∶5 000的比例接种于CECs悬液中,在不同培养条件下,通过单因素试验初步确定培养基配方、培养温度、接种MOI及培养时间4大工艺参数范围,再以正交试验确定上述条件的最佳组合。结果单因素试验初步确定的工艺参数:采用M2或M3,培养温度为33~36℃,MOI=0.01~0.001 FFU/细胞,培养时间为72~120 h,可获得较高的病毒滴度(7.0 lg FFU/ml以上)。正交试验确定的最佳工艺条件:采用M3,培养温度为33℃,MOI=0.01 FFU/细胞,培养时间为120 h,该工艺参数获得病毒滴度可达7.5 lg FFU/ml。结论本实验优化了CECs培养RV的工艺,CTNCEC25株的病毒滴度由约6.0 lg FFU/ml提高至7.0 lg FFU/ml以上,为疫苗生产获得理想抗原量奠定了基础。     

感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

几种乙炔加压设备性能的比较

阐述并比较了几种加压设备在乙炔加压清净过程中的性能和特点。     

A study of miscibility of blends of polybutadienes of varying microstructure

The miscibility of various amorphous polybutadienes with mixed microstructures of 1,4 addition units (cis, 1,4 and trans 1,4) and 1,2 addition units have been investigated. The studies here involved optical transparency, differential scanning calorimetry, and small angle light scattering. It was found that a 90 percent (cis) 1, 4 addition polybutadiene was immiscible with high (91 percent) 1,2 addition polybutadiene. Reduction of the 1,2 content to 71 percent induced an upper critical solution temperature (UCST) with the cis 1,4 polymer. Polybutadienes with 50 percent and 10 percent 1,2 contents were miscible above the crystalline melting temperature of the cis 1,4 polybutadiene. Immiscibility of the 91 percent 1,2 addition polymer was also found with a 10 percent 1,2 polybutadiene. The latter polymer also exhibits an UCST with the 71 percent 1,2 polymer. The results are used to interpret the characteristics of blends of polybutadienes of varying microstructure.     

粉煤灰中烧失量检测的不确定度分析

以F类粉煤灰为例,详细介绍了测定粉煤灰中烧失量的步骤、计算数学模型、影响测量不确定度的因素以及各项测量不确定度分量评定,人员、设备、材料、方法、环境都是影响测量不确定的因素。