耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的原核表达及其纯化

目的原核表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)转肽酶区,并进行纯化及鉴定。方法 PCR扩增编码PBP2a转肽酶区的mec Af基因片段,克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组表达质粒p GEX-6p-mec Af,经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定正确后,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21进行诱导表达;经蛋白亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组表达质粒p GEX-6p-mec Af经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定证明构建正确;表达产物的相对分子质量约63 000,表达量约占菌体总蛋白的14.5%,纯化后纯度达90%。结论成功构建了PBP2a转肽酶区的原核表达质粒,目的蛋白在E.coli中获得高效表达,为制备单克隆抗体及建立MRSA快速检测方法奠定了基础。     

梅毒螺旋体特异抗原TP0684的克隆和表达

目的克隆并表达梅毒螺旋体外膜蛋白TP0684,为研制早期诊断试剂盒提供依据。方法PCR法扩增TP0684编码基因。T-A克隆后构建表达质粒pET-22b(+)-TP0684,经酶切鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了1212bp的目的片段,原核表达质粒pET-22b(+)-TP0684酶切鉴定正确,测序结果与GenBank上公布的该基因的CDS序列完全一致。转化E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约43000,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TP0684重组蛋白具有良好的免疫反应性,为进一步研究梅毒血清学诊断试剂奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。     

屋尘螨变应原Derp 5在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的克隆表达屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Derp)第5组变应原Derp 5基因,在E.coli中表达、纯化重组Derp 5蛋白,并分析其血清Ig E反应原性。方法以合成的Derp 5核酸序列为模板进行PCR扩增,产物经双酶切后与载体pCold-TFM连接,构建重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。用镍离子亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白,尘螨过敏患者血清鉴定其IgE反应原性。结果重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的可溶性高表达,毎升细菌表达产物经纯化可得到纯度95%以上的Derp 5蛋白约6 mg。纯化的重组Derp 5蛋白与尘螨过敏患者血清IgE有结合活性。结论成功构建了Derp 5原核表达载体,高效表达并纯化了目的蛋白,纯化的重组Derp 5蛋白具有良好的IgE反应原性,为屋尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及致敏蛋白的进一步研究奠定了基础。     

人膜联蛋白A3的原核表达及纯化

目的 原核表达人膜联蛋白(annexin,ANX)A3(ANX A3),并进行纯化。方法 提取人胎盘样品总RNA,反转录建立c DNA文库,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增anx A3基因编码区全长,连接至克隆载体p EASY-Blunt上,测序鉴定。用primix extaq酶重新扩增anx A3基因,与表达载体p EASY-E1连接,构建重组表达质粒p EASY-anx A3,转化E.coli Transetta DE3,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His纯化介质及Bio-Rad Bio Logic Duo Flow Chromatography Systems纯化后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定,阳性克隆可扩增出972 bp的目的片段,与NCBI中Gen Bank上报道的anx A3序列完全一致。纯化的重组蛋白相对分子质量约为36 000,可与鼠Anti 6×His-Tag单克隆抗体特异性结合,浓度为400μg/ml。结论 成功构建了重组原核表达质粒p EASY-anx A3,并在E.coli Transetta DE3中表达了重组蛋白,为进一步研究ANX A3在哮喘病的起因和形成中的作用及机制奠定了基础。     

多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E. coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组蛋白的相对分子质量约80 000,纯化后蛋白浓度为518. 9μg/mL。在加入10μg PPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645. 16±32. 98)U/mg。结论成功在E. coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础。     

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68~410 aa)重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202~1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化EcoliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1 000 bp的目的片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。     

森林脑炎病毒包膜E蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性初步评价

目的原核表达及纯化森林脑炎病毒(tick-bome encephalitisvirus,TBEV)包膜E蛋白,并初步评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增TBEV E蛋白基因,克隆至载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET-28a-TBEV E,转化感受态E. coli BL21(DE3),挑取阳性克隆,扩增后经终浓度为0. 1 mmol/L的IPTG诱导,表达产物经12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。将鉴定正确的重组蛋白采用镍柱亲和法纯化,铝佐剂吸附后,经小鼠左侧腹腔注射,0. 5 mL/只,间隔1周加强免疫1次,末次免疫后7、14、21、28、35、42、49 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法测定小鼠血清抗体水平。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-TBEV E构建正确。表达产物相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式表达,表达量约22. 3%,且可与小鼠抗TBEV血清发生特异反应,纯化后纯度达90%。末次免疫后21 d,小鼠血清抗体效价达最高,为1∶6 400。结论经原核表达系统成功表达并纯化了TBEV E蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,本实验为TBEV诊断制剂及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。