水痘-带状疱疹病毒84-7株基因特征分析

目的 分析水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)84-7株的基因特征。方法 利用PCR法分别扩增VZV84-7株ORF38(PstⅠ)、ORF54(BglⅠ)、ORF62(SmaⅠ、Bss HⅡ、NaeⅠ)共5个酶切位点片段,运用生物信息学软件对5个酶切位点进行分析;PCR扩增病毒复制起点,分析VZV84-7株复制起点特征;PCR扩增VZV84-7株g E基因,对该基因进行序列分析。结果 VZV84-7株的酶切位点特征为:PstⅠ~+BglⅠ~+SmaⅠ~-Bss HⅡ~-NaeⅠ~-;复制起点区域包含1个13TA+19GA结构;g E基因序列与Oka株相比,在第1 170位存在1个碱基差异,为C→A,属于无义突变,但编码区氨基酸序列同源性为100%。结论 VZV84-7株的酶切位点和复制起点均有特异性,同时VZV84-7株与Oka株的g E基因仅有1个碱基突变,氨基酸序列同源性为100%。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。     

水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析

目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株与临床分离株可变区基因的序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)Oka株(V-Oka株)与分离于临床水痘患者的野毒株进行可变区基因序列比对分析。方法提取V-Oka株和VZV临床分离株的基因组DNA,对其串联重复序列区(R区)进行PCR扩增和测序;将R3基因的纯化产物与pMD18-T载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,提取质粒,经双酶切鉴定及测序;将测序结果与GenBank中登录的V-Oka株基因序列进行比对分析。结果 R1～R5基因扩增产物及R3基因重组质粒的双酶切产物片段大小均与预期相符;V-Oka株较稳定,测序结果与GenBank中登录的V-Oka株R1～R5基因序列一致,野毒株R区序列呈现多态性,与V-Oka株有差异,R4区序列区别明显。结论水痘患者的致病毒株为野毒株;R4的重复单位拷贝数可为临床快速鉴别V-Oka株与野毒株提供科学的手段。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性及基因序列差异位点分析

目的研究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性,并对不同代次毒株进行全基因测序及差异位点分析。方法将VZV Oka株在SV-1细胞株上连续传至48代,检测病毒滴度。对VZV Oka株33、35、38、39及48代病毒进行全基因测序,应用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件进行数据的拼接及序列分析。结果 VZV Oka株在SV-1细胞上连续传代获得的33~48代病毒滴度在4.000~4.625 lg CCID50/ml之间,病毒滴度的算数平均值为4.292 lg CCID50/ml;VZV Oka株基因组全长125 114 bp,GC含量46%;33、35、38、39、48代病毒的核苷酸序列同源性为99.99%,这5代病毒与标准疫苗株V-Oka的核苷酸序列同源性为99.96%;VZV Oka株在MRC-5、SV-1细胞上制备的38代病毒全基因序列有1个差异位点;本研究中的各代次病毒基因序列高度同源,与Varivax和Varilrix疫苗株、野毒株Dumas及亲本株p-Oka相比,与疫苗株V-Oka的同源性最高。结论 VZV Oka株在SV-1细胞上的适应性及遗传稳定性均良好。     

国内外卡介菌的分子遗传学特性

目的比较我国生产用卡介菌上海菌株与国际常用卡介菌亚株(巴斯德1173P2株、法国F6株、丹麦1331株、丹麦2株、日本172株、Connaught)在分子遗传学上的差异。方法应用PCR和多重PCR方法,对国内外不同卡介菌的各缺失区(RD1、RD2、RD8、RD14、RD16、nRD18、RDDenmark/Glaxo)、插入序列IS6110拷贝数及基因座SenX3-Regx3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海菌株(BCG Chinese)缺失RD1和RD2,不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDen-mark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有3个串联重复序列,PCR产物为353bp;巴斯德1173P2株缺失RD1、RD2、RD14和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;法国F6株缺失RD1、RD2和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦1331株缺失RD1、RD2及RDDenmark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦2株与丹麦1331株相似,只是SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列和3个串联重复序列并存的现象;日本172株只缺失RD1,RD16只显示401bp的产物,含有2个IS6110插入序列;Connaught株缺失RD1、RD2、RD8及nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有1个串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海菌株与国外其他卡介菌亚株在分子遗传学特性上有一定的差异。     

脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗中Ⅲ_2株全基因测序及序列分析

目的对脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗中Ⅲ2株全基因进行测序,并与P3/Leon/37株和SabinⅢ株的全基因序列进行同源性比较。方法通过大片段克隆和小片段克隆两种方法,采用RT-PCR法扩增覆盖中Ⅲ2株基因组全长且互相重叠的4个大片段和8个小片段,基因组中间片段的PCR产物直接测序,基因组末端的片段先进行TA克隆再测序。分别将两种方法得到的c DNA片段进行拼接,并将所得全长c DNA序列与P3/Leon/37株和SabinⅢ株的全基因序列进行同源性比较。结果两种方法均能得到长度为7 432 bp的中Ⅲ2株全长c DNA序列,且碱基序列完全一致;中Ⅲ2株全基因序列与P3/Leon/37株和SabinⅢ株全基因序列的同源性均为99%;中Ⅲ2株与P3/Leon/37株的碱基序列差异共有19处(非编码区3处和编码区16处),编码区有6个基因突变导致氨基酸序列的改变;中Ⅲ2株和SabinⅢ株的碱基序列差异共有28处(非编码区13处和编码区15处),编码区有3个基因突变导致氨基酸序列的改变。结论中Ⅲ2减毒疫苗株全基因组c DNA序列为7 432 bp,与SabinⅢ株全基因序列的同源性为99%。     

禽脑脊髓炎病毒VP1、VP3、VP0基因表达载体的构建

根据AEV-NH937基因组全序列设计3对引物,应用RT-PCR方法,扩增出AEV的外壳蛋白VP1、VP3、VP0基因,将它们克隆于pUCm-T载体上进行序列分析.结果显示,AEV-NH937病毒株VP1基因全长810 bp、编码270个氨基酸,VP3基因全长735 bp、编码245个氨基酸,VP0基因全长726 bp、编码242个氨基酸;与Calnek疫苗株相比,AEV-NH937病毒株VP1、VP3、VP0基因的核苷酸同源性分别为90.62%、93.88%、95.45%,氨基酸同源性分别为88.89%、97.96%、98.35%.将VP1、VP3、VP0基因分别插入载体pcDNA4/HisMax构建表达重组质粒并转入宿主菌DH5α中,使基因得以表达.     

流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析

目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。     

肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析

目的对肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因进行核苷酸序列分析,了解该毒种的基因稳定性。方法根据汉坦病毒标准株设计特异的PCR引物,用RT-PCR技术分段扩增疫苗株84FLi株的M和S基因片段,PCR产物纯化后直接测序,并进行遗传进化分析。结果疫苗株84FLi株M基因片段的核苷酸序列与GenBank中收录的HTN型毒株的M基因核苷酸序列的同源性为83.5%～99.9%,而与SEO型毒株的同源性为70.2%～72.0%。其S基因与HTN型毒株的同源性为85.9%～99.6%,与SEO型毒株的同源性为69.4%～70.8%。疫苗株84FLi株的M和S基因的氨基酸序列与GenBank中收录的HTN型汉坦病毒84FLi株M和S基因的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和99.5%。从遗传进化树上可以看出,疫苗株84FLi株与GenBank中收录的84FLi株位于一个独立的分支上,与其他HTN型病毒亚型分布于不同分支上,与其他HTN型病毒亚型亲缘关系较远。结论肾综合征出血热灭活疫苗毒株84FLi株M和S基因片段的核苷酸和氨基酸序列未发生较大变异,说明在传代过程中该疫苗株在基因水平上并未发生较大改变。     

水痘-带状疱疹病毒gE糖蛋白基因扩增法鉴别水痘减毒活疫苗

目的利用水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE糖蛋白基因鉴别水痘减毒活疫苗。方法以提取的病毒DNA为模板,PCR扩增gE糖蛋白基因。经琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果水痘减毒活疫苗Oka株VZV(病毒滴度≥2.0lgPFU/ml)通过琼脂糖电泳均可见特异性的条带。使用同样的方法检测麻疹减毒活疫苗、麻疹-腮腺炎联合疫苗、风疹减毒活疫苗以及Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(病毒滴度≥4.2lgCCID50/ml),结果均为阴性。结论gE糖蛋白基因可以作为VZV的特异性指标,进行病毒鉴别试验。     

2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析

目的分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征。方法对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒,经RT-PCR扩增血凝素(H)基因片段,克隆到pMD19-T载体,进行酶切鉴定及序列测定,并分析核苷酸序列,与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较。结果RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570bp的片段,克隆至pMD19-T载体后,酶切鉴定结果与预期相符。3株麻疹病毒均属H1基因型,其H基因之间同源性为98.5%～99.6%,与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比,在核苷酸水平上最大变异为9.7%。3株病毒与H1a参考株Chin93-2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0.007～0.015、0.013～0.021和0.015～0.023。结论H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株。     

水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2～3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。     

甲型肝炎病毒Js-4株经人二倍体细胞传代后的核苷酸序列分析

目的分析甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)Js-4株经人二倍体细胞MRC-5传代后的核苷酸序列变异情况。方法将HAV Js-4株经Vero细胞适应14代获得的原始株Js-4-V14经人二倍体细胞MRC-5于35℃连续适应培养15代,取其中8个适应株(Js-4-M2、Js-4-M3、Js-4-M4、Js-4-M5、Js-4-M10、Js-4-M12、Js-4-M14、Js-4-M15)及原始株,提取病毒基因组RNA,通过RT-PCR扩增病毒全基因组,采用生物信息学软件DNAstar Lasergene 7进行序列分析。结果 8个适应株全基因组与Js-4-V14株的核苷酸序列同源性在99.8%～100.0%之间;第5代适应株在5′-NCR(101～200 bp)发生较大变异,表现为105～157 bp缺失,之后该突变稳定遗传;第10、12、14、15代适应株在2A(3 012～3 210 bp)区段3 122位点发生点突变;8个适应株和Js-4-V14毒株与野毒株HM175为同一基因亚型,均为IB型;9个毒株的主要抗原位点与野生株HM175完全一致。结论 HAV Js-4-V14株在MRC-5细胞传代适应过程中,主要抗原位点未发生突变,其与细胞适应性和病毒增殖有关的基因在传代早期已经变异,传代后期这些变异保持相对稳定。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。