百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化

目的采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-toushemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化。方法调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析;PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析。纯化产物经4%～12%NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度;LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测;PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率。结果纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95%以上;PT和FHA的总回收率均在30%左右;电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源。结论采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间。     

建立我国百日咳组分纯化疫苗质量标准的探讨

百日咳组分纯化疫苗相对于共纯化疫苗,成分明确,更安全有效,更利于质量监管。我国的百日咳组分纯化疫苗已研制成功并开始应用,旧的共纯化苗质量标准已不适用,国际上尚无统一的组分苗质量标准。本文借鉴国内外研究,从疫苗有效成分(组分抗原)、安全性和有效性检测方面,对建立我国百日咳组分纯化疫苗的质量标准进行探讨。     

百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体。方法从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达。表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性。以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制备的单抗进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达;纯化的重组Prn蛋白的纯度达95%以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合。获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应。结论原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

中空纤维超滤和疏水层析大规模纯化质粒DNA

目的建立适合大规模纯化质粒DNA的工艺。方法采用碱裂解、中空纤维超滤浓缩、疏水层析、分子筛等分离技术纯化质粒DNA。结果纯化后的质粒DNA纯度达95%以上,整个工艺流程总产率为58%,各项指标均符合药用质粒DNA质量标准。结论此纯化工艺简便,产率较高,为DNA疫苗大规模纯化奠定了基础。     

重组人促红细胞生成素纯化工艺

目的 建立适合大规模生产重组人促红细胞生成素（EPO）的纯化工艺。方法 采用无血清培养分泌rEPO工程菌,收集培养上清,经离心、超滤、离心交换层析、分子筛层析纯化。结果 所纯化的rEPO纯度达99％以上,比活性为1.3×105IU/mg,活性回收率为47％,相对分子质量为40 000,等电点为 3.5。免疫印迹证明具有天然EPO的免疫原性。结论 该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

无细胞百日咳疫苗中活性PT的保护作用

目的 比较经基因工程方法脱毒的无细胞百日咳疫苗(APV)中不同含量活性PT的保护作用。方法 用小鼠保护性试验(AMPT)评价不同含量活性PT疫苗样品的百日咳效力,组织胺致敏试验(HST)检测不同含量PT样品中PT活性。结果 含5ng活性PT的疫苗与不含PT的疫苗效力差异无显著意义;含50ng活性PT疫苗与不含和含5ng活性PT的疫苗效力差异有显著意义。用HST肛温测定法可以检测到含50ng活性PT的样品中PT活性。结论 AMPT适用于高度脱毒或基因工程脱毒的APV的效力检定,HST肛温测定法可以证实APV中PT的活性。     

去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。     

BCA法检测组分百日咳疫苗中间品蛋白含量的可行性评价

目的评价BCA法检测组分百日咳疫苗中间品蛋白含量的可行性,并进行验证。方法以《中国药典》三部(2015版)Lowry法2的检测结果为对照,对干扰BCA法测定组分百日咳疫苗中间品蛋白质含量的物质进行分析,明确干扰物质的限度;对BCA法的专属性、线性范围、重复性、准确性进行验证,并与Lowry法2的检测结果进行比较。结果 30%硫酸铵对Lowry法2和BCA法测定蛋白质含量有明显干扰,其他缓冲体系均无影响;硫酸铵浓度≤25%时,对Lowry法2检测结果无干扰,低于5%的硫酸铵可通过1 mol/L的盐酸消除,不影响BCA法的测定;凯氏定氮法测定结果显示,组分百日咳疫苗中间品中硫酸铵浓度<5%。BCA法的专属性、线性范围、重复性、准确性均符合验证要求;Lowry法2与BCA法检测结果差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 BCA法操作简便、快速、准确、高通量,可用于检测组分百日咳疫苗中间品的蛋白含量。     

人血小板衍生生长因子-BB在酿酒酵母中的表达及纯化工艺的建立

目的建立重组人血小板衍生生长因子-BB(hPDGF-BB)在酿酒酵母中的表达及纯化工艺。方法在5L发酵罐中,探讨接种量、溶氧、诱导温度和诱导pH值对菌体密度及目的蛋白表达量的影响,并通过离子交换层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化。结果重组hPDGF-BB工程菌在5L发酵罐分批补料培养中,经84h发酵,细胞A600值可达65.1,目的蛋白表达量占26%。纯化后的蛋白纯度可达95%,产量为15.4mg/L,收率为21.9%。结论已建立了周期短、产率高的hPDGF-BB发酵及纯化工艺,为其大规模生产奠定了基础。     

疏水作用层析在重组大肠杆菌表达的rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化中的作用

目的建立rProEMAPⅡ/P43蛋白的纯化工艺,明确疏水作用层析(HIC)在纯化中的作用。方法采用由疏水作用层析、离子交换层析、亲和肝素层析组成的工艺对rProEMAPⅡ/P43蛋白进行纯化,并与由离子交换层析和亲和肝素层析组成的工艺相比较,分别进行总蛋白含量测定、SDS-PAGE分析目的蛋白含量及纯度检测。结果在pH为7·4~7·5时,采用HIC方法纯化的蛋白较不采用HIC法回收率提高了28·4%,纯化后rProEMAPⅡ/P43蛋白纯度为92%。结论在rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化过程中增加疏水作用层析,可以提高rProEMAPⅡ/P43蛋白收率。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗纯化方法的研究

目的 建立简便、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。方法 采用超滤浓缩、醋酸锌沉淀和柱层析（亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析）等方法，对出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗进行提纯对比试验。结果 用超滤浓缩和Sepharose 4FF凝胶柱层析或用醋酸锌沉淀和凝胶柱层析，纯化的疫苗均可达到质量标准，而用 cellufine sulfate gel亲和层析和离子交换层析均不理想。结论 建立了经济、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。     

重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的　探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法　将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果　融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论　已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立

目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺。方法采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63lgCCID50/ml,DNA残留量均<100pg/ml。除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降。结论已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV。