血管紧张素转换酶2过表达对大鼠急性心肌梗死后心室重构的影响及其分子机制

目的探讨血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)过表达对大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心室重构的影响及其可能的分子机制。方法采用开胸结扎冠状动脉法建立SD大鼠AMI模型,将模型大鼠随机分为MI、MI+(NS)、MI+AdEGFP、MI+AdACE2组,另设SHAM(假手术)组,每组15只,MI+NS、MI+AdEGFP和MI+AdACE2组沿心肌梗死周边区选取5个点,通过直接心肌内注射方式分别注射NS、AdEGFP和AdACE2,SHAM和MI组不注射。术后4周末,采用Western blot法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2、α-SMA、MKP-1、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、TGF-β1蛋白的表达;HE染色后于普通显微镜下观察心肌组织结构及细胞炎症变化,天狼猩红-饱和苦味酸染色后于普通显微镜及偏振光显微镜下分别观察心肌胶原表达分布情况;SP免疫组化染色法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达,同时采用ELISA法检测Ang(1-7)蛋白的表达;使用羟脯氨酸试剂盒检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中羟脯氨酸含量。结果术后4周末,MI+AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2蛋白的表达量显著高于其他各组,同时Ang(1-7)蛋白的表达量也显著升高(P<0.05);与SHAM组相比,MI、MI+NS、MI+AdEGFP组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达量显著升高(P<0.05),MI+AdACE2组与MI、MI+NS、MI+AdEGFP组相比,AngⅡ、α-SMA蛋白表达水平降低,Ang(1-7)蛋白表达水平升高更显著;与MI、MI+NS、MI+AdEGFP各组相比,MI+AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中MKP-1蛋白的表达水平明显增加(P<0.05),p-ERK、P38、TGF-β1蛋白的表达水平降低,羟脯氨酸含量显著降低(P<0.05);HE染色和天狼猩红-饱和苦味酸染色证实,ACE2对AMI后梗死周边区的炎症反应和胶原重塑均有明显的改善作用。结论 ACE2在心肌过表达能有效改善大鼠AMI后心肌梗死周边区心肌纤维化进程,缓解心室重构,其机制可能与ACE2调节肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system,RAS)、平衡丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)活性相关。     

血脂康对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的观察血脂康对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖及胶原合成的影响,并探讨可能的分子机制。方法采用胰酶消化法分离培养Sprague-Dawley大鼠心肌成纤维细胞,建立AngⅡ诱导CFs增殖的模型,以MTT比色法和流式细胞仪检测细胞周期分析法观察血脂康对CFs数目和细胞周期的影响。AngⅡ及不同浓度血脂康作用48 h后,用天狼星红染色法检测培养上清中胶原的含量;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1蛋白表达;RT-PCR法检测胶原和TGF-β1 mRNA表达。结果AngⅡ对CFs增殖有明显促进作用,血脂康可明显抑制AngⅡ诱导的CFs增殖,且呈剂量依赖性;血脂康可增加G0/G1期细胞百分率,降低S、G2/M期细胞百分率,降低胶原含量、TGF-β1蛋白及胶原和TGF-β1 mRNA的表达。结论血脂康能抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原的产生,其作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的。     

血管紧张素Ⅱ基因重组杆状病毒的构建

目的构建携带血管紧张素I(IAngiotensin Ⅱ,AngⅡ)基因的重组杆状病毒,并利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行表达。方法将重组杆粒bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rB/HAngⅡ)转染昆虫细胞sf9,包装出重组杆状病毒rBac-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rBAV),通过光学显微镜和透射电镜观察细胞病变(CPE)及病毒形态,采用蚀斑试验检测病毒滴度,PCR及间接免疫荧光技术验证该病毒及感染细胞中AngⅡ和HAV蛋白的表达。结果重组杆粒rB/HAngⅡ转染sf9细胞96 h后,出现典型的CPE;透射电镜下观察可见典型的杆状病毒颗粒;PCR可特异性的扩增出约3 000和1 000 bp的P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因片段;P3代重组杆状病毒滴度约为4×108pfu/ml;感染后的sf9细胞中可见特异性的绿色荧光(AngⅡ蛋白)和红色荧光(HAV结构蛋白)。结论已成功构建了携带AngⅡ基因的重组杆状病毒,并在sf9细胞中获得表达,为研制抗高血压疫苗提供了新的思路。     

牛磺酸对新生大鼠心肌成纤维细胞一氧化氮系统的影响

目的观察牛磺酸(Taurine,Tau)在血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblast,CFb)增殖的过程中对诱导型一氧化氮合酶-一氧化氮(iN0S-NO)系统的影响,以揭示Tau抑制CFb增殖的初步机制。方法胰酶消化法分离培养新生大鼠CFb,用AngⅡ诱导促进其增殖,采用MTT法检测细胞增殖;羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量;ELISA法测定转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白的含量;流式细胞仪检测细胞周期;硝酸还原酶法、分光光度法和免疫荧光法检测CFb NO含量、一氧化氮合酶(iNOS)活性和iNOS蛋白的表达。结果Tau(40、80和160mmol/L)可抑制AngⅡ诱导的CFb增殖、胶原合成增加及TGF-β1蛋白含量增多,同时使细胞G0/G1期百分率增加,S期细胞百分率降低,并明显提高CFb NO含量、iNOS的活性及iNOS蛋白的表达量,且呈现剂量依赖性。结论牛磺酸通过提高CFbiNOS-NO系统的活性,拮抗AngⅡ的部分生物效应,致使CFb的增殖和胶原合成受到抑制。     

姜黄素对转化生长因子-β1诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9表达及其侵袭能力的影响

目的研究姜黄素对转化生长因子-β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP-9)表达及其侵袭能力的影响,探讨姜黄素在防治TGF-β1诱导的乳腺癌侵袭转移中可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测姜黄素对MDA-MB-231细胞的细胞毒性作用。将MDA-MB-231细胞分为阴性对照组(无血清RPMI1640培养基/DMSO)、TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基/DMSO+10 ng/ml TGF-β1),姜黄素+TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基+5、7.5、10μmol/L姜黄素+10 ng/ml TGF-β1)。处理24 h后,采用侵袭小室试验观察细胞的侵袭能力;处理不同时间后,采用Western blot法检测细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2以及p-p38的表达,明胶酶谱法检测各组细胞上清液中MMP-9的活性变化;以ERK特异性抑制剂PD98059、p38特异性抑制剂SB202580、姜黄素和/或TGF-β1处理细胞48 h,采用Western blot和明胶酶谱法检测MMP-9的表达。结果低浓度姜黄素(≤10μmol/L)对MDA-MB-231细胞无明显的细胞毒性作用;姜黄素呈剂量依赖性明显减少了TGF-β1诱导的细胞穿膜数量(P<0.001);姜黄素可显著抑制TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2及p-p38蛋白的表达,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05);姜黄素随浓度的增加,对TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9活性的抑制作用明显增强(P<0.05);PD98059抑制MMP-9蛋白表达及活性的作用与姜黄素相似,而SB202580对MMP-9无明显影响。结论姜黄素可能通过TGF-β/Smad、TGF-β/ERK信号通路下调TGF-β1诱导的MMP-9的表达及其活性,从而抑制肿瘤的侵袭能力。     

福辛普利对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA转录水平的影响

目的探讨福辛普利对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA转录水平的影响,为阐明NASH的发病机制及探索新的治疗策略提供实验依据。方法将40只雄性SD大鼠用普通饲料喂养1周后,随机分为4组:正常对照组(NC组,普通饲料+生理盐水1 ml灌胃)、高脂组(HC组,高脂饲料+生理盐水1 ml灌胃)、药物对照组[NF组,正常饲料+福辛普利3.6 mg/(kg.d)灌胃]和药物干预组[HF组,高脂饲料+福辛普利3.6 mg/(kg.d)灌胃],每组10只。给药24周后,分析各组大鼠肝组织病理学变化,检测各组大鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、血管紧张素转换酶(Angiotensin-convert ingenzyme,ACE)、ACE2、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)和Ang(-1-7)的水平;RT-PCR检测各组大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA的转录水平;Western blot检测各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的表达水平。结果给药24周后,HF组非酒精脂肪性肝病活动度评分和肝纤维化程度与HC组相比,均明显下降(P<0.001);HF组血清中ALT、ALP、TG、LDL、TGF-β、ACE和AngⅡ的水平均明显低于HC组(P<0.05),而ACE2和Ang(-1-7)的水平均明显高于HC组(P<0.05);福辛普利可显著降低肝组织ACE基因mRNA的转录水平(P<0.001)和CollagenⅠ蛋白的表达水平(P<0.01),升高ACE2基因mRNA的转录水平(P<0.01)。结论福辛普利可能通过下调ACE和上调ACE2的生成和表达,从而降低AngⅡ和升高Ang(-1-7)的生成,具有改善NASH和抗肝纤维化作用。本实验为阐明NASH的发病机制及探索新的治疗策略提供了实验依据。     

血管紧张素转化酶基因多态性与特发性肺纤维化相关性

目的探讨血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与特发性肺纤维化(IPF)患者的相关性;监测IPF患者血浆中血管紧张素转化酶(ACE)活性、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的变化。方法应用PCR技术扩增ACE基因目的片段检测基因多态性;采用紫外吸收法测定ACE酶的活性;采用竞争放射免疫分析法测定AngⅡ水平。结果(1)IPF患者与正常对照组的D等位基因频率及DD基因型分布有显著性差异(P<0.05)。(2)IPF患者与正常对照组的血浆ACE活性与AngⅡ水平有显著性差异(P<0.05)。结论(1)ACE基因I/D多态性与IPF发病有关,DD基因型是肺纤维化发病的危险因素。(2)血循环中ACE活性和AngⅡ水平升高与肺纤维化病变有关,两者可以促进肺纤维化的发生、发展。     

大肠埃希菌诱导小肠上皮细胞产生β防御素-3的机制

目的探讨大肠埃希菌诱导小肠上皮细胞产生β防御素-3(mouseβ-defensin 3,mBD-3)的机制。方法用大肠埃希菌作用于小肠上皮细胞0、24和48 h后,MTT法检测细胞增殖情况;免疫组化荧光法检测mBD-3的表达;Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中p-ERK1/2、p-JNK及p-p38的表达。结果大肠埃希菌作用小肠上皮细胞48 h时,细胞生长率最低,为(7. 12±0. 31)%;mBD-3的表达在48 h时最高;p-ERK1/2的表达在48 h时最高,显著高于0和24 h(P 0. 01)。结论大肠埃希菌抑制小肠上皮细胞的增殖,并促进mBD-3的表达,这种促进机制是通过ERK1/2途径实现。     

ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌细胞后小鼠β-防御素-2表达的影响

目的探讨ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞后小鼠β-防御素-2(mouseβ-defensin-2,m BD-2)表达的影响及作用机制。方法采用RNA干扰的方法抑制MFC细胞中ERK1/2的表达,并经G418筛选稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot法检测ERK1/2基因的抑制效率。用10~3个/ml的沙门菌对干扰组及对照组(未转染)的MFC细胞分别作用4、8及12 h,通过Western blot法检测m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)的磷酸化水平。同时采用MTT法检测沙门菌作用两组MFC细胞12、24及48 h时的生长情况。结果RT-PCR和Western blot法检测结果表明,ERK1/2基因抑制效果显著。沙门菌作用MFC细胞后4、8和12 h后,各时间点间干扰组细胞中m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)蛋白磷酸化水平差异无统计学意义(P0.05),且均显著低于各时间点的对照组(P0.05)。沙门菌作用12和24 h,干扰组细胞的抑制率明显高于对照组(P0.05),作用48 h时,两组细胞的抑制率差异无统计学意义(P0.05),细胞几乎全部死亡,且干扰组细胞抑制率的增加速度较快,作用24 h时已达97.7%。结论ERK1/2抑制可明显降低沙门菌侵袭MFC后m BD-2的表达水平,表明ERK1/2可调控m BD-2的表达。     

苦味西葫芦果实木脂素类成分研究

采用色谱技术对苦味西葫芦果实的抗炎活性部位的化学成分进行分离,应用1HNMR、13CNMR确定化合物的结构.从正丁醇萃取部位分离得到4个木脂素化合物:Larisiresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、( )-5'-Methoxyisolarisiresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside(Ⅱ)、Lyoniside(Ⅲ)、Isolariciresinol-9-O-β-D-xylopyranoside(Ⅳ).化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均为首次从南瓜属植物中分离得到.     

6,11-二氢二苯骈[b,e]氧杂-11-酮-2-乙酸的合成

采用对羟基苯乙酸(Ⅱ)和苯酞为原料,在甲醇钠的催化下,以n(Ⅱ)∶n(苯酞)∶n(甲醇钠)=1.0∶1.1∶2.2,于130℃反应7h制备4-(2-羧基苄氧基)苯乙酸(Ⅲ)。Ⅲ与乙酰氯经氯化、环合得6,11-二氢二苯骈[b,e]氧杂-11-酮-2-乙酸(Ⅰ),该步优化的反应条件为:n(Ⅲ)∶n(乙酰氯)=1∶1.25,反应温度为100℃,反应时间为6h。以Ⅱ计,总收率达48.16%,Ⅰ的结构经IR、1H NMR和MS确证。     

2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-巯基-吡喃葡萄糖的合成

以无水α-D-葡萄糖为原料通过四步反应完成2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-巯基-吡喃葡萄糖的合成.首先用α-D-葡萄糖和乙酸酐合成1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖(Ⅰ),再由(Ⅰ)和溴素、冰醋酸制得2,3,4,6-四-O-乙酰-α-D-溴代吡喃葡萄糖(Ⅱ),然后用(Ⅱ)和硫脲制得2-S-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-异硫脲氢溴酸盐(Ⅲ),最后加入氯仿和偏重亚硫酸钠制得最终产物2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-巯基-吡喃葡萄糖(Ⅳ).通过FTIR、元素分析、1HNMR、13C-NMR等手段对产物结构进行了表征.     

N-β-羟丙基-1,2-丙二胺的合成

以环氧丙烷(Ⅰ)和1,2-丙二胺(Ⅱ)为原料,采用反应蒸馏的方法合成N-β-羟丙基-1,2-丙二胺(Ⅲ),通过单因素实验和正交实验确定了合成过程的最佳工艺条件。合成的最佳工艺条件为n(Ⅰ)∶n(Ⅱ)=1∶1,反应温度50℃,反应时间4h。在最佳工艺条件下,1,2-丙二胺的转化率可达85.12%,N-β-羟丙基-1,2-丙二胺的收率为69%。     

2-氯-5-三氟甲基吡啶

2-氯-5-三氟甲基毗啶(Ⅲ)纯品为白色粉末,熔点:30℃0,沸点:152℃。 1.制法以β-甲基毗啶(Ⅰ)为原料,经氯化制得2-氯-5-三氯甲基吡啶(Ⅱ)后,再同氟化氢反应,就可得到2-氯5-三氟甲基吡啶(Ⅲ)。 2.生产日本制造公司仅石原产业公司一家,产品几乎全部作为除草剂毗氟丁禾灵(fluazifop-butyl)原药的合成原料自用。据日本GMO株式会社推算,1988～1989年的生产量约300～500吨/年。     

吡咯并[2,3-c]氮杂卓-4,8-二酮衍生物的合成

将N-(2-吡咯甲酰基)-β-丙氨酸甲酯(Ⅲ)与卤代烃经烷基化反应得到的产物水解,得到N-(1-烷基-2-吡咯甲酰基)-β-丙氨酸(Ⅱa～Ⅱc),收率84.7%～91.2%;以化合物Ⅱ为原料,在多聚磷酸-P2O5作用下,经分子内环化反应合成了标题化合物1-烷基-6,7-二氢-1H,5H-吡咯并[2,3-c]氮杂-4,8-二酮(Ⅰa～Ⅰc),收率69.1%～77.2%。3步反应总收率为61.8%～69.1%。测定了3个标题化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。     

2,3-内醚-D-葡萄糖苷合成的探讨

对-甲苯基4,6-苯亚甲基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)经二步反应得到对．甲苯基α-2,3-内醚-4,6-苯亚甲基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)。在制备过程中,对2-OH和3-OH的对甲苯磺酰化反应活性差异进行了初步探讨。通过改变温度(-10～60℃)和改变Ⅰ和对甲基苯磺酰氯(TsCl)的物料比(1：1～1：3)的正交试验,仅分离得到对-甲苯基3-对甲基苯磺酰基-4,6-苯亚甲基-1-硫-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ),其产率不超过60％。同时,也对Ⅲ的分离纯化工艺进行了研究。     

氮苷1-(2,′3,′4,′6′-O-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-咪唑的制备

以D-葡萄糖(Ⅰ)、醋酸酐为原料,在无水吡啶中制得中间体1,2,3,4,6-O-五乙酰基-D-葡萄糖(Ⅱ),收率为87.5%。在HB r/CH3COOH条件下对Ⅱ异头碳上的乙酰基进行溴代,制得1-溴-2,3,4,6-O-四乙酰基-D-葡萄糖(Ⅲ),不经分离,在相转移催化剂TEBA催化下,Ⅲ直接与2,4-二硝基苯酚反应得到酚苷1-O-(2,′4′-二硝基苯)-2,3,4,6-O-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ),最后Ⅳ与1-三甲基硅基-咪唑在无水四氯化锡的催化下,室温反应52 h制得氮苷1-(2,′3,′4,′6′-O-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-咪唑(Ⅴ),此步反应收率为90%。     

6,11-二氢二苯骈[b,e]氧杂(艹卓)-11-酮-2-乙酸的合成

采用对羟基苯乙酸(Ⅱ)和苯酞为原料,在甲醇钠的催化下,以n(Ⅱ):n(苯酞):n(甲醇钠)=1.0:1.1:2.2,于130℃反应7 h制备4-(2-羧基苄氧基)苯乙酸(Ⅲ).Ⅲ与乙酰氯经氯化、环舍得6,11-二氢二苯骈[b,e]氧杂(艹卓)-11-酮-2-乙酸(Ⅰ),该步优化的反应条件为:n(Ⅲ):n(乙酰氯)=l:1.25,反应温度为100℃,反应时间为6 h.以Ⅱ计,总收率达48.16%.Ⅰ的结构经IR、1H NMR和MS确证.     

氮苷1-(2'''',3'''',4'''',6''''-O-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-咪唑的制备

以D-葡萄糖(Ⅰ)、醋酸酐为原料,在无水吡啶中制得中间体1,2,3,4,6-O-五乙酰基-D-葡萄糖(Ⅱ),收率为87.5%.在HBr/CH3COOH条件下对Ⅱ异头碳上的乙酰基进行溴代,制得1-溴-2,3,4,6-O-四乙酰基-D-葡萄糖(Ⅲ),不经分离,在相转移催化剂TEBA催化下,Ⅲ直接与2,4-二硝基苯酚反应得到酚苷1-O-(2',4'-二硝基苯)-2,3,4,6-O-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ),最后Ⅳ与1-三甲基硅基-咪唑在无水四氯化锡的催化下,室温反应52 h制得氮苷1-(2',3',4',6'-O-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-咪唑(Ⅴ),此步反应收率为90%.     

6-烃氧基-2-烷硫基腺苷化合物的合成及抗血小板凝聚活性

以鸟嘌呤核苷(Ⅰ)为原料,经羟基保护得到2',3',5'-三-O-乙酰基鸟嘌呤核苷(Ⅱ),Ⅱ与三氯氧磷反应得到2-氨基-6-氯-9-(2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤(Ⅲ),Ⅲ再进行重氮-烷硫化反应,生成2-烷硫基-6-氯-9-(2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤(Ⅳ),Ⅳ与醇进行亲核取代反应同时脱去糖环保护得到8个6-烃氧基-2-烷硫基嘌呤腺苷化合物(Ⅴ)。化合物的结构经1HNMR、13CNMR、IR和HRMS表征,同时对合成的目标化合物进行了体外抗血小板凝聚活性测试。结果表明,在测试浓度为10μmol/L时,6-(2-呋喃甲基)氧基-2-丙硫基腺苷具有较高的抗血小板凝聚活性。