重组弓形虫热休克蛋白70联合弗氏佐剂免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的评价重组弓形虫热休克蛋白70(rTgHSP70)联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠的抗弓形虫感染作用。方法BALB/c小鼠70只,随机分为7组,分别为PBS组、A组(佐剂+PBS)、20PA组(20μg rTgHSP70+佐剂)、40P组(40μgrTgH-SP70)、40PA组(40μg rTgHSP70+佐剂)、60PA组(60μg rTgHSP70+佐剂)及80PA组(80μg rTgHSP70+佐剂),皮下免疫,间隔2周,加强免疫2次,共免疫3次。末次免疫后14d,用2×104个RH株弓形虫速殖子/只灌胃攻击各组小鼠,攻击后30d处死,ELISA检测血清IgG和肠液sIgA;分离脑组织内弓形虫速殖子,并计数。结果在添加佐剂组中,血清IgG水平随rTgHSP70剂量的增加而升高,与PBS组和A组比较,差异有统计学意义;肠液sIgA水平60PA组最高,与20PA和40PA组比较,差异有统计学意义;与PBS组相比,A、20PA、40P、40PA、60PA和80PA组的脑组织内速殖子数分别减少了56.87%、56.46%、61.90%、48.74%、62.87%和70.44%。结论rTgHSP70联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠可诱导一定的抗弓形虫感染作用,80μgrTgHSP70为较佳剂量。     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的特异性抗体动态观察

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的血清IgG、粪便和鼻咽冲洗液中IgA特异性抗体动态,探讨其抗弓形虫感染作用机制。方法96只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以弓形虫复合黏膜疫苗(20μl/只)滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。分别于滴鼻2次(间隔2周)后第1、2、3、4、6、8、10和12周处死小鼠,收集血清、粪便及鼻咽冲洗液,采用ELISA法检测血清IgG以及粪便和鼻咽冲洗液中IgA抗体。结果实验组小鼠血清IgG、粪便及鼻咽冲洗液中IgA均高于对照组,血清IgG水平第3周达高峰,第14、6和8周显著高于对照组;粪便IgA抗体第2周达高峰,第2、3和4周显著高于对照组;鼻咽冲洗液中IgA第1周即达高峰,之后逐渐降低,至第12周仍显著高于对照组。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导高水平的特异性抗体,且可持续较长时间。     

重组弓形虫Peroxiredoxin蛋白诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

目的观察不同剂量重组弓形虫Peroxiredoxin蛋白(rTgPrx)诱导小鼠的体液免疫、细胞免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用。方法BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别用20、40、60、80μgrTgPrx(溶于100μlPBS中)和100μlPBS皮下免疫小鼠3次,间隔2周。末次免疫后第14天,用1×104个速殖子/只灌胃攻击,逐日观察小鼠健康状况。攻击后第30天,ELISA法检测小鼠血清IgG和小肠冲洗液sIgA水平,分离并计数脾淋巴细胞和小肠上皮内淋巴细胞(IEL),分离肝、脑组织内弓形虫速殖子并计数。结果60μgrTgPrx组小鼠血清IgG水平显著高于PBS、20μg和40μgrTgPrx组,小肠冲洗液sIgA组间比较差异无统计学意义;80μgrTgPrx组小鼠脾淋巴细胞数量明显高于PBS和20μgrTgPrx组,IEL数量各组间差异无统计学意义;60μg和80μgrTgPrx组小鼠脑和肝组织虫荷均低于PBS和20μgrTgPrx组。结论60μg和80μgrTgPrx皮下免疫小鼠可诱导有效的体液免疫、细胞免疫应答,且抗弓形虫感染的保护作用效果良好。     

弓形虫STAg不同接种途径免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)经滴鼻、灌胃和皮下注射3种途径免疫小鼠诱导的免疫应答。方法5~6周龄BALB/c小鼠32只,随机分为4组,分别以20μgSTAg滴鼻、灌胃或皮下注射免疫小鼠2次,间隔2周,对照组不作处理。末次免疫后14d脱颈椎处死小鼠,分离脾淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞(IELs)并计数,ELISA法测定血清、肠冲洗液中的弓形虫特异性抗体。结果滴鼻组和皮下注射组的脾淋巴细胞数量高于灌胃组和对照组,灌胃组与对照组相近。滴鼻组的IELs数量高于皮下注射组、灌胃组和对照组,皮下注射组和灌胃组与对照组一致。皮下注射组的血清IgG水平高于滴鼻组、灌胃组和对照组,滴鼻组略高于灌胃组和对照组,但差异无显著意义。滴鼻组的小肠冲洗液sIgA水平高于皮下注射组、灌胃组和对照组,皮下注射注射组和灌胃组略高于对照组,差异无显著意义。结论20μgSTAg滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答优于灌胃和皮下注射;皮下注射免疫小鼠诱导的血清IgG抗体水平高于滴鼻和灌胃,但其未能诱导黏膜免疫应答。     

弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的脾与肠相关淋巴组织细胞免疫效应及动态变化

目的观察弓形虫与Vero细胞共培养提取的排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的脾及肠相关淋巴组织(GALT)细胞免疫效应及动态变化。方法84只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以ESA(20μg/只)为抗原,对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液(20μl/只),鼻内免疫2次,间隔2周。末次滴鼻后第1、2、3、4、5、6、7周处死小鼠,分离脾、派伊尔结(PP)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL)并计数。结果实验组小鼠脾淋巴细胞第3周达高峰,第1、2、3周明显高于对照组;PP淋巴细胞明显增生,第3周达高峰,第1、2、3、4、5周显著高于对照组;IEL第2周增生达高峰,第1～3周显著高于对照组。结论弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导不同黏膜部位及系统特异性的细胞免疫应答,且可持续较长时间。     

细胞膜表面异位表达热休克蛋白70的CD4~+T细胞诱导EAE小鼠保护性免疫作用

目的探讨细胞膜表面异位表达热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在T细胞疫苗(T cell vaccine,TCV)诱导保护性免疫中的作用。方法建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55)诱发的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis,EAE)模型,以MOG35-55肽特异性CD4~+T细胞为疫苗,经尾静脉免疫小鼠。对EAE小鼠的临床神经功能进行评分,流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节T细胞(Treg)百分比、ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子IFNγ、IL-4、IL-10和IL-17含量。结果射线照射可诱导活化CD4~+T细胞表面异位表达HSP70;HSP70~+T组小鼠症状显著轻于HSP70-T封闭组(P 0. 01);HSP70~+T组小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞百分比、脾细胞上清中IL-4、IL-10含量均显著高于HSP70-T组(P 0. 01),而IFNγ、IL-17含量均显著低于HSP70-T组(P 0. 01)。结论细胞膜表面异位表达HSP70在活化T细胞诱导的保护性免疫中发挥重要作用。     

热休克蛋白70过表达对过氧化氢诱导BRL细胞caspase 3表达的影响

目的探讨热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)70过表达对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导Buffalo大鼠肝细胞(BRL细胞)cleaved caspase 3表达的影响。方法将BRL细胞分为6组:空白对照组、Ad-CMV-Null组、Ad-CMV-Hsp70组、H_2O_2组、Ad-CMV-Null+H_2O_2组和Ad-CMV-Hsp70+H_2O_2组,Ad-CMV-Null、Ad-CMV-Hsp70、AdCMV-Null+H_2O_2、Ad-CMV-Hsp70+H_2O_2组分别加入1×10~7 PFU/ml的Ad-CMV-Null或Ad-CMV-Hsp70培养48 h后,H_2O_2、Ad-CMV-Null+H_2O_2和Ad-CMV-Hsp70+H_2O_2组分别加入150μmol/L H_2O_2处理2 h,空白对照、Ad-CMVNull和Ad-CMV-Hsp70组分别加入培养液培养。分别采用实时荧光定量PCR检测细胞中Hsp70基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞中Hsp70及cleaved caspase 3蛋白的表达水平。结果与H_2O_2组相比,Ad-CMVHsp70+H_2O_2组细胞中Hsp70基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均显著升高(P0.01),cleaved caspase 3蛋白表达水平显著下降(P0.01)。结论Hsp70可抑制caspase 3的激活最终保护BRL细胞,减少凋亡损伤。     

STAg联合蜂胶佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用

目的探讨可溶性速殖子抗原(STAg)联合蜂胶佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用及蜂胶的适宜剂量。方法将60只BALB/c小鼠随机分为5组,每组12只,分别用20μgSTAg、20μgSTAg+5μg蜂胶、20μgSTAg+10μg蜂胶、20μgSTAg+20μg蜂胶及20μgSTAg+40μg蜂胶鼻内免疫小鼠2次,间隔14d。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子灌胃攻击,4×104个/只,观察小鼠存活情况。攻击后第30天处死全部小鼠,分离计数小鼠脑、肝组织内速殖子和肠系膜淋巴结淋巴细胞(MLNL)、脾T淋巴细胞;ELISA法检测小鼠肺冲洗液、粪便弓形虫特异性sIgA和血清IgG抗体水平。结果随着蜂胶剂量的增加,小鼠脑、肝速殖子数呈下降趋势,20μgSTAg+40μg蜂胶组显著低于20μgSTAg组,脑、肝组织减虫率分别为46.10%和60.11%;MLNL和脾T淋巴细胞增殖活性提高,其中20μgSTAg+40μg蜂胶组小鼠MLNL和脾T淋巴细胞数分别为(2.09±0.24)×107和(1.89±0.21)×107,均显著高于20μgSTAg组;肺冲洗液、粪便弓形虫特异性sIgA和血清IgG抗体水平呈增高趋势,但各组间差异无统计学意义。结论STAg联合蜂胶佐剂鼻内免疫小鼠可有效诱导抗弓形虫感染的保护作用,适宜的蜂胶剂量为40μg。     

重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合白细胞介素-2或干扰素γ诱导小鼠的脾淋巴细胞免疫应答

目的观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(Recombinant Toxoplasma gondii phosphoglycerate mutase 2,rTgPGAM2)联合白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)或干扰素γ(Interferonγ,IFNγ)滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答,探讨IL-2和IFNγ的佐剂效应。方法将48只BALB/c小鼠随机均分为6组:rTgPGAM2组(30μg)、IL-2组(500 IU)、IFNγ组(1 000 IU)、rTgPGAM2(30μg)+IL-2(500 IU)组和rTgPGAM2(30μg)+IFNγ(1 000 IU)组和对照组(20μl PBS),免疫途径均为滴鼻免疫,共免疫3次。末次免疫后第14天,颈椎脱臼处死小鼠,CCK-8法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖活性,ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4和IL-10水平。结果经rTgPGAM2刺激后,与对照组比较,各免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(Stimulation index,SI)均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);经ConA刺激后,仅IL-2组SI显著高于对照组(P<0.01)。各免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-2和IFNγ含量均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);rTgPGAM2组及其联合IL-2或IFNγ组IL-4含量显著高于对照组(P<0.05);而IL-10的含量,只有IFNγ组和rTgPGAM2+IFNγ组显著高于对照组(P<0.05)。结论 rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ鼻内免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答优于rTgPGAM2单独免疫,表明IL-2和IFNγ具有良好的佐剂效应,IL-2的佐剂效应更佳。     

肺炎链球菌热休克蛋白ClpE多克隆抗体的制备及其亚细胞定位

目的制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)热休克蛋白(heat shock protein,HSP)ClpE多克隆抗体,并确定ClpE在S.pn表面的亚细胞定位。方法应用PCR法从S.pn D39中扩增clpE基因全长片段,克隆入原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价,Western blot法鉴定抗体的特异性。ELISA法分析ClpE在S.pn表面的亚细胞定位。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的重组ClpE蛋白相对分子质量约83 000,表达量约占全菌总蛋白的60%,主要以可溶性上清形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%;制备的ClpE多克隆抗体效价达1∶4 096 000,可与S.pn D39全菌发生特异性反应,S.pn D39在正常生长时可表达ClpE蛋白;ClpE在S.pn表面有表达。结论成功制备了高效价和特异性的ClpE多克隆抗体,ClpE在S.pn表面可正常表达,为表面蛋白。