真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN的构建及其在HEK 293-6E细胞中的表达

目的构建真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,并在HEK 293-6E细胞中进行表达。方法合成融合基因CTP-PTEN,定向克隆至真核表达载体pTT5中,构建重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,进行双酶切及测序鉴定。在Lipofectamine 2000的介导下,将鉴定正确的重组表达质粒转染至HEK 293-6E细胞,Western blot法检测细胞中融合蛋白CTP-PTEN的表达。结果经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒pTT5-CTPPTEN构建正确。转染48 h后,HEK 293-6E细胞中可见相对分子质量约49 700的CTP-PTEN融合蛋白条带。结论成功构建了重组质粒pTT5-CTP-PTEN,并于HEK 293-6E细胞中表达了CTP-PTEN融合蛋白。     

腺苷酸激酶4慢病毒过表达质粒的构建及鉴定

目的构建腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4,AK4)慢病毒过表达质粒,并进行鉴定。方法从Hep G2细胞中扩增AK4基因,将其克隆至载体LV5,构建重组质粒LV5-AK4,经测序鉴定后,将鉴定正确的LV5-AK4和包装质粒p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G共转染HEK293T细胞,包装慢病毒;将慢病毒原液进行10倍系列稀释(10~(-1)~10~(-4)),感染HEK293T细胞,检测病毒滴度;慢病毒感染Hep G2细胞,Western blot法检测AK4蛋白的表达水平。结果重组质粒LV5-AK4经测序鉴定证明构建正确,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为5×10~8 TU/ml。试验组Hep G2细胞中AK4蛋白的表达水平显著高于空白对照组及阴性对照组(P0.01)。结论成功构建了携带AK4基因的重组慢病毒过表达质粒,为进一步研究低氧应激细胞中AK4的功能及其分子作用机制奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

人S100A8重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。     

人源大麻素Ⅰ型受体基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建人源大麻素Ⅰ型受体(human cannabinoid receptor 1,hCBⅠ)基因GV230真核表达质粒,并于HEK-293细胞中进行表达。方法以人脑皮质细胞的总RNA为模板,扩增获得hCBⅠ基因,克隆至真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCBⅠ,筛选阳性克隆,脂质体瞬时转染HEK293细胞。置倒置荧光显微镜下观察,并采用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)和Western blot法检测hCBⅠ基因在HEK293细胞中的表达。结果重组表达质粒GV230-hCBⅠ经双酶切及测序鉴定,构建正确。转染48 h后,转染率约40%,CBⅠ蛋白主要于细胞膜分布及表达,且于相对分子质量约50 000处可见特异性条带。结论成功构建了重组真核表达质粒GV230-hCBⅠ,并于HEK293细胞中表达,为进一步研究CBⅠ的生物学功能奠定了基础。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

小鼠Fancd2os基因真核表达质粒的构建及其对人胚肾上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的构建小鼠Fancd2os基因的真核表达质粒,并分析Fancd2os基因对人胚肾上皮细胞(HEK293T)增殖和凋亡的影响。方法以小鼠睾丸组织DNA为模板扩增Fancd2os基因c DNA全长片段,并克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-14,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os。经Lipofectamine TM 2000将重组真核表达质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中Fancd2os基因m RNA转录及蛋白表达情况;经CCK8法和流式细胞术分别检测过表达Fancd2os对HEK293T细胞增殖能力及紫外线诱导HEK293T细胞凋亡的影响。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建正确;转染p3×Flag-CMV-14-Fancd2os的HEK293T细胞可见Fancd2os基因m RNA转录及其蛋白表达;过表达Fancd2os的HEK293T细胞的增殖活性显著下降(P0.05);过表达Fancd2os可显著促进紫外线诱导的HEK293T细胞凋亡(P0.01)。结论成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-Fancd2os,过表达Fancd2os可抑制HEK293T细胞的增殖,促进其凋亡。     

人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选

目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株。方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒)。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因m RNA转录及蛋白的表达水平。结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功。经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株。与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因m RNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P0.05)。结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

PLCε基因shRNA重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达PLCε基因shRNA的重组腺病毒质粒Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究膀胱癌的基因治疗奠定基础。方法将干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6及shRNA序列克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的穿梭质粒pAdTrack,经酶切及测序鉴定正确后,将重组穿梭质粒经PmeI线性化,转化感受态AdEasier。重组pAdEasy-U6-PLCε质粒经PacI线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,经大量扩增后测定病毒滴度,RT-PCR及Western blot检测T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdEasy-U6-PLCε质粒构建正确,并成功转染至HEK-293细胞,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012,经重组腺病毒感染的T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论已成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。     

小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1真核表达质粒的构建及其RNA干扰靶点的筛选

目的构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒,并筛选其RNA干扰靶点。方法从BALB/c小鼠睾丸组织中扩增mINCA1基因,插入真核表达载体pMSCVpuro,构建重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1,转染人胚肾HEK 293T细胞,转染48 h后,分别采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达。设计并合成针对mINCA1基因的4个RNA干扰质粒,分别与质粒pMSCVpuro-mINCA1共转染HEK293T细胞,采用Western blot法筛选mINCA1基因的干扰靶点。结果 PCR、双酶切及测序结果证实重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1构建正确;pMSCVpuro-mINCA1质粒转染的HEK 293T细胞中有mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达;干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1和PGPU6/GFP/Neo-shRNA3可显著降低mINCA1蛋白的表达量。结论成功构建了mINCA1基因真核表达质粒,并筛选出mINCA1基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究mINCA1基因的功能及作用机制奠定了实验基础。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。     

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。     

Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

目的构建Lipocalin-2(Lcn-2)基因真核表达质粒PL-2,并检测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响。方法利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增Lcn-2基因,克隆入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建重组质粒PL-2。转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基因的表达。将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Westernblot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确。经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达。加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响。结论已成功构建了Lcn-2基因真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋白对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖。     

重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达

目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease inhibitor,RI)基因的重组腺相关病毒,并在膀胱癌细胞T24中表达。方法 Trizol法提取人脐静脉内皮细胞ECV30总RNA,经RT-PCR扩增RI基因,克隆至pUCm-T质粒中,再亚克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体,构建pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒,与pAAV-RC和pAAV-Helper质粒共转染HEK293细胞,包装并扩增腺相关病毒RI-AAV,检测其感染性滴度,并转染T24细胞,采用RT-PCR检测RI基因mRNA的转录水平,Westernblot检测RI蛋白的表达水平。结果重组质粒pAAV-IRES-hrGFP-RI经酶切及测序鉴定构建正确;重组腺相关病毒RI-AAV的感染性滴度为1.1×1010U/ml;RI-AAV转染的T24细胞RI基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平较未转染组及空病毒转染组均显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论已成功构建人RI基因重组腺相关病毒,为进一步研究RI对膀胱癌细胞的侵袭和转移的作用奠定了基础。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。