钩端螺旋体疫苗鉴别试验及其国家参考品的建立

目的建立钩端螺旋体疫苗鉴别试验方法,制备系列免疫血清作为国家参考品。方法应用疫苗生产用菌株免疫家兔,制成免疫血清,冻干后进行标定,并经上海生物制品研究所和武汉生物制品研究所两单位采用试管凝集试验进行验证。结果冻干参考品血清效价符合要求,协作标定14批钩端螺旋体疫苗,结果一致。结论所制备的冻干参考品合格。钩端螺旋体疫苗鉴别采用试管凝集试验是可行的。     

中国15群钩端螺旋体代表菌株分群血清参考品的研制

目的研制中国15群钩端螺旋体代表菌株的分群血清参考品。方法制备1批冻干钩端螺旋体15群候选分群参考血清,与国内15株代表菌株进行显微镜凝集试验,同时组织协作标定,并对冻干候选制剂进行稳定性分析。结果冻干的血清候选参考品外观色泽均匀、形态饱满,水分含量均3%。每个协作实验室检测结果的室内和室间变异系数(CV)均低于15%。各血清候选参考品于-20℃保存24个月的抗体滴度与协作标定及于-20℃保存12个月的结果差异无统计学意义(P0.05)。结论研制的中国15群钩端螺旋体代表菌株分群血清参考品具有良好的稳定性,可用于钩体菌株血清分群和菌体疫苗鉴别试验。     

adr亚型HBsAg冻干实验参考品的制备与检测

目的制备用于检测重组酵母表达的adr亚型HBsAg含量的实验参考品。方法重组酵母表达的adr亚型HBsAg溶液经纯化后,经3家实验室联合标定蛋白含量,准确稀释并加入保护剂,使抗原最终含量为10μg/ml,分装安瓿后,冷冻干燥熔封,制备成adr亚型实验参考品。再由不同实验室用不同试剂和不同方法,以联合标定的蛋白含量为定量标准,分别验证冻干参考品中adr亚型HBsAg含量及37℃放置不同时间的稳定性。并以adw亚型HBsAg标准作为定量标准,检测adr亚型参考品中HBsAg含量。结果所制备的adr亚型冻干参考品分装准确均匀;以联合标定蛋白含量为标准,不同实验室分别以珠式EIA法和RIA法所测的adr亚型冻干参考品HBsAg含量与目标含量相近,各支参考品间差异小;adr亚型冻干实验参考品37℃放置2～10周后质量稳定。以adw亚型HBsAg参考品为定量标准,所测定adr亚型冻干参考品HBsAg含量,比实际含量约高出0.6倍。结论冻干adr亚型HBsAg实验参考品可用于重组酵母表达adr亚型HBsAg的定量检测。不同亚型HBsAg检测需用各自亚型的参考品作为定量标准。     

冻干重组乙型肝炎疫苗国家参考品的制备及标定

目的 制备1批冻干参考品,用于体外相对效力测定准确评价重组(啤酒酵母)乙肝疫苗的生物学活性。方法 疫苗原液中分别加入5％和1％的蔗糖和明胶作为保护剂,制成冻干参考品。检测各项质量指标并观察其稳定性,并以Merck公司的参考品为标准,以ELA法协作标定其体外相对效力。结果 各项质量指标均符合现行规程要求,体外相对效力保持稳定,分装量准确,原液蛋白均值为24.72μg/ml,相应液体疫苗蛋白均值为12.27μg/ml。并经3家实验室协作标定,24次检定结果合并计算相对效力为0.993。结论 该冻干参考品可用作重组啤酒酵母乙肝疫苗效力检定的质控参考品,该批参考HBsAg含量定为11.0μg/ml。     

乙型脑炎灭活疫苗效力参考品的制备及稳定性

目的　制备乙型脑炎灭活疫苗国家效力参考品。方法　按《中国生物制品规程》要求制备乙型脑炎灭活疫苗原液 ,经超滤处理后加入冻干保护剂 ,制成冻干参考品并进行检测标定。结果　经检测 ,效力参考品外观、水分、无菌试验、效力试验均合格 ,稳定性好 ,且T值可保持在较高水平。结论　该批乙型脑炎灭活疫苗效力参考品可作为国家效力参考品     

第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品。方法从国内11省市几十万名供血员中筛选出871份样品,以多种试剂对其进行复核,对备选参比品样品再进行免疫荧光吸收法检测,并对人类免疫缺陷病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、类风湿因子及非特异性抗体进行检测。根据样品复检及确证结果,选定30份样品,分装并分发至11个实验室,进行会同标定。结果已制备出第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品,并建立了相应的质量标准。结论第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品已被国家有关部门批准正式使用。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

以IU为单位的乙型肝炎病毒核心抗体国家参考品的建立

目的建立以IU为单位的乙型肝炎病毒核心抗体(hepatitis B core antibody,HBcAb)国家参考品。方法从我国多个省份血液中心和采浆站收集血清、血浆样品300份,应用5家国产和2家进口HBcAb诊断试剂初步筛选,并采用WHO国际HBcAb标准品进行标定,同时验证初步筛选获得的参考品的稳定性及适用性。结果建立了HBcAb国家参考品,包括阴性参考品15份、阳性参考品15份、灵敏度参考品1份、精密性参考品1份。其中灵敏度参考品经WHO国际HBcAb标准品标化后定量为5 IU/ml,19家发光试剂和酶联免疫试剂的最低检出限均值分别为0.67及0.53 IU/ml。参考品经4℃、常温、37℃保存及反复冻融后与置-20℃保存的参考品在阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、最低检出限及精密性等方面的结果均一致。5家国产试剂检测阴性参考品符合率均为15/15,阳性参考品符合率均为15/15,其中3家试剂的最低检测限高于1.0 IU/ml,精密性CV均20%。结论成功建立了以IU为单位的HBcAb国家参考品,且具有良好的稳定性及适用性,为提高HBcAb诊断试剂的质量奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核酸检测试剂国家参考品的制备

目的制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸检测试剂国家参考品。方法收集我国不同地区的献血员血浆,用核酸筛查试剂筛查HCV RNA情况,并通过PCR法对人细小病毒B19进行定性测定,筛选阳性参考品、阴性参考品和最低检出限参考品。对HCV RNA阳性样本进行基因分型;3家实验室以WHO HCV RNA国际标准品为对照品,对参考品进行协同标定;并检测参考品的稳定性和适用性。结果筛选出10份HCV阳性,而HBV、HIV、B19均为阴性的样本作为阳性参考品,其中有6份为1b型,1份为2a型,1份为3a型,1份为3b型,1份为6a型;10份HCV、HBV、HIV、B19均为阴性的样本作为阴性参考品;1份冻干的HCV RNA阳性,HBV、HIV、B19为阴性的样本作为最低检出限参考品,基因型为1b型。3个实验室经协作标定,阴性参考品的结果均为阴性,阳性参考品的HCV RNA浓度在104~105 IU/ml之间,最低检出限参考品的HCV RNA浓度为6.18×106 IU/ml。-20℃放置4周、4℃放置12 d、室温放置7 d以及反复冻融5次对参考品的HCV RNA含量无明显影响。参考品适用于目前国内市场上主要国产血液筛查和定量试剂的检测。结论制备了HCV核酸检测试剂国家参考品,可用于HCV核酸诊断试剂的质量评价和控制。     

丙型肝炎抗体ELISA诊断试剂质控参考品的建立

以国际2代丙型肝炎诊断试剂为参考，经ABBOTT、UBI、科华、亚利等国内、外试剂对3000余份血清进行反复筛查，还采用了分片段ELISA试剂及RIBA、PCR等方法进一步核检，建立了我国第1代丙型肝炎诊断试剂质控参考品，包括阳性、阴性、灵敏度和精密性参考品。用所建质控参考品对69批次国产试剂进行检测，并与国外试剂相比较，证明有较好的分辨力。并制定了我国丙型肝炎诊断试剂检测标准，此标准及参考品已获卫生部批准。用所建质控参考品对3家攻关单位的丙型肝炎诊断试剂进行了多次检测，结果表明单纯用合成肽抗原制成的试剂都存在灵敏度低、阳性参考品检出少的缺点。     

重组人CTAL4-Ig活性测定参考品的制备及标定

目的　建立用于效价测定的重组人CTAL4 Ig参考品。方法　按WHO标准品有关要求制备参考品 ,分装、冻干后进行检测 ,采用Raji细胞体外活性测定法进行标定。结果　冻干重组人CTAL4 Ig参考品经检测外观、无菌实验合格 ,水分为 2 2 % ,经 10次标定活性值位于 336～ 4 6 3U/支 ,平均值为 4 19U/支 ,10次结果的标准差为36 0 3U/支 ,变异系数为 8 6 1% ,加速热稳定实验表明其生物学活性在 - 2 0℃、4℃和 2 5℃下 12个月保持稳定。结论　该批重组人CTAL4 Ig活性参考品各项指标均符合标准品的要求 ,效价定为 4 0 0AU/支 ,编号为 2 0 0 2 /0 1。     

抗C(IgM)血型定型试剂国家参考品的研制

目的研制抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)效价测定用国家参考品。方法筛选抗C(IgM)杂交瘤细胞,获得培养上清液,根据效价进行稀释,经冻干为国家参考品。对其进行分装均匀性、冻干后的外观、水分、效价检测,并联合多家实验室进行协作标定,同时进行瓶间精密度及热稳定性检测。结果国家参考品为白色冻干粉末,复溶后外观为无色或淡黄色透明液体,平均水分含量为1.70%,分装瓶间均匀性良好。经协作标定,抗C血型定型试剂(单克隆抗体)对CC红细胞的效价为1∶16,对Cc红细胞的效价为1∶8。瓶间精密度效价检测结果均一致。参考品于37℃放置3、7、14 d后,与-20℃保存的参考品效价一致。结论成功制备了抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)国家参考品,可用于抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)效价检测的质量控制。     

甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品的建立

目的建立甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品,并制定其质量标准。方法收集并扩增流感病毒阳性及阴性菌毒株,对其进行组织细胞半数感染量(TCID50)/菌落计数及核酸序列测定,并使用不同流感病毒核酸诊断试剂进行筛查检测,选择不同样本进行冻干后组成参考品;使用不同试剂对参考品进行协作标定,根据标定结果,确定甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品的质量标准,并考察其稳定性。结果甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品由19份样本组成,包括阴性参考品6份、阳性参考品6份、精密性参考品2份及最低检出限参考品5份。甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品的质量标准为:阳性参考品符合率6/6;阴性参考品符合率6/6;精密性≤5.0%;最低检出限参考品:S1为2.1×103 TCID50/L(即1∶104稀释),S2为2.0×103 TCID50/L(即1∶103稀释),S3为2.5×101TCID50/L(即1∶104稀释),S4为1.0×103 TCID50/L(即1∶103稀释),S5为9.8×101 TCID50/L(即1∶104稀释)。25℃放置1 d及反复冻融3次均不影响参考品的稳定性。结论建立了甲/乙型流感病毒核酸检测试剂参考品,并制定了其质量标准,为相应试剂的质量控制和评价提供了依据。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的制备

目的制备冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力检测。方法配制含氢氧化铝的保护剂,加入抗原至规定浓度,使各组分含量分别为明胶1%、蔗糖5%、氢氧化铝0.9mg/ml、抗原10μg/ml,分装冻干,制成冻干参考品,并对其理化指标进行全面检定。采用小鼠效力试验方法检测冻干对疫苗效力的影响,并比较冻干参考品与同批液体疫苗的稳定性。结果冻干参考品各项指标均符合规程要求,冻干前后疫苗效力无明显变化,冻干参考品与同批液体疫苗效力差异无显著意义,37℃热加速8周,冻干参考品效力未见显著下降,液体疫苗效力则明显下降。结论冻干对疫苗效力无影响,冻干参考品热稳定性良好。     

戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品的建立

目的制备戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品。方法从我国多省血液中心、采浆站收集血清、血浆样品300份,应用国内外5家HEV IgG抗体诊断试剂进行筛选,制备HEV IgG国家参考品,并对参考品的稳定性及适用性进行检测。结果制备了HEV IgG国家参考品,其中阴性参考品30份;阳性参考品10份;灵敏度参考品1份,依据HEV IgG国际标准品进行标化,定量为3 U/ml;精密性参考品1份。参考品经4℃及室温放置10 d,37℃放置7 d,以及反复冻融3次后,测定结果与-20℃放置参考品检测结果一致,稳定性良好。5个厂家试剂对参考品的检测结果显示该参考品具有较好的适用性。结论制备了戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品,为提高诊断试剂的质量奠定了基础。     

第6套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第6套丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体诊断试剂国家参考品。方法从我国10省市血站及生物制品企业的供血员中筛选候选参考品血浆样本304份,采用国内外27种检测试剂进行HCV Ag、HCV Ab及HCV RNA检测后,应用CHIRON公司的RIBA HCV 3.0 SIA及MP公司HCV BLOT 3.0试剂进行确证检测;利用Abbott Real Time HCV GenotypeⅡ试剂,对HCV RNA阳性样本进行HCV基因型别检测,并以核苷酸序列测定方法对分型样本进行确认。通过分析上述检测数据,从中拟选出协作标定样本,邀请国内外生产或市场使用占较大份额的11个实验室参加该套参考品标定。取最低检出限参考品4份,分别于4、25和-20℃放置1、3、5、7、9和11 d,或置-70℃反复冻融1~6次,进行稳定性试验。结果选出65份样品组成第6套HCV抗体诊断试剂国家参考品,其中包括阴性参考品30份,阳性参考品30份,最低检出限参考品4份,精密性参考品1份。应用11家的16种HCV抗体试剂分别平行3次标定检测,阴、阳性参考品符合率均≥29/30;最低检出限参考品检测L1~L3均为阳性,L4为阴性;精密性参考品检测CV在1%~11%之间。不同温度保存11 d及-70℃保存反复冻融6次的检测结果均符合要求(P0.05)。结论建立了应用于血液筛查丙型肝炎病毒抗体试剂质量控制的第6套HCV抗体国家参考品。     

第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品。方法从国内13省市几十万名供血员中筛选样品,用多种试剂对收集到的2000多份血样进行复检,从中选出317份样品,用国外3种抗-HCV EIA试剂及国内4种抗-HCVEIA试剂进行检测,对可能被选入参考品的样品,再用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂,HCV RNA PCR试剂和CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证。利用HCV基因分型试剂对部分样品进行HCV基因型别检测,并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法确证。21个实验室会同标定。结果建立了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品及相应的质量标准。结论自2004年10月1日起,第5套抗-HCV国家参考品已被国家有关部门批准正式使用。     

柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂国家参考品的建立

目的 建立柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CA16)核酸检测试剂国家参考品，并制定其质量标准。方法收集并筛选CA16核酸阳性和阴性样本，分装、冻干后，建立CA16核酸检测试剂国家参考品。采用不同企业的试剂对参考品进行协作标定，根据协作标定结果确定参考品的质量标准，并考察其均匀性和稳定性。结果 CA16核酸检测试剂国家参考品由9份阳性参考品，8份阴性参考品，1份检测限参考品和1份精密度参考品组成。其质量标准为：阳性参考品符合率≥8/9；阴性参考品符合率为8/8；最低检测限为稀释度不低于1∶103；精密度参考品稀释100倍后重复检测10次，结果均为阳性，且Ct值的CV≤5%。该参考品均匀性符合要求，室温(25℃)放置1 d、反复冻融3次均未影响参考品的稳定性。结论 建立了首批CA16核酸检测试剂国家参考品，并制定了质量标准，为相关试剂的质量控制和评价提供了依据。     

重组水蛭素生物学活性检测参考品的制备和标定

目的制备重组水蛭素(Hirudin)生物学活性检测参考品,并标定其生物学活性。方法按照WHO相关规定制备、分装和冻干参考品,经全面检测合格,用TH生色底物法进行体外生物学活性检测。结果外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%。经过10次标定,平均生物学活性为12 701 ATU/支,标准差为2 226 ATU/支,变异系数为17.5%。在-20℃、4℃和25℃条件下,生物学活性可以稳定保持9个月。结论该批重组水蛭素各项指标均符合要求,性质稳定,可作为国家参考品,用于重组水蛭素的生物学活性检测。     

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

采用罐培养百日咳CS菌株,培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后,再经蔗糖密度梯度离心,收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原,经福尔马林解毒,制备成原液。该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后,加入保护剂,稀释至18μgPN／ml,分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。以JNIH3和JNIH－6参考品为标准,按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果,该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。