拟南芥AGO基因家族分析及盐胁迫下的表达验证

argonaute(AGO)蛋白家族成员在小核糖核酸(RNA)介导的转录后调控中有重要作用.通过拟南芥AGO蛋白家族的结构域及各类植物中的AGO蛋白的进化关系进行分析,发现AGO蛋白在植物中结构和进化相对保守.根据已有的芯片数据,对拟南芥中AGO蛋白家族的组织表达进行分析,发现某些AGO基因具有组织表达的特异性.进一步通过基因上游启动子响应元件分析,以及盐等胁迫下的芯片和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验数据分析,发现AGO2、AGO3和AGO7等基因受到盐等非生物胁迫的诱导表达.初步探明了拟南芥中AGO基因家族在盐胁迫下的差异表达规律.     

核苷酸转移酶与玉米非生物胁迫响应

核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3'末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.     

大豆ASR表达提高酵母和烟草细胞对Cu~(2+)耐受力

利用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,证明大豆幼苗在150μmol/L Cu SO4胁迫3 h后,其叶和根内Gm ASR基因表达均上调.将大豆Gm ASR基因转化Cu2+敏感型酵母菌ΔCUP 2和烟草悬浮细胞BY-2,Gm ASR蛋白的表达可增强重组酵母和转基因烟草细胞抗Cu2+胁迫的能力.利用大肠杆菌表达体系表达、分离并纯化大豆Gm ASR蛋白,体外实验证明,Gm ASR蛋白可与Cu2+结合,并具有清除羟基自由基的能力.研究结果推测,ASR蛋白可通过螯合Cu2+降低细胞内Cu2+浓度,提高植物对Cu2+胁迫的耐受力.     

利用酵母表达体系研究大豆SALI3-2蛋白功能

以含有大豆Sali3-2cDNA的重组载体为模版,扩增出SALI3-2蛋白及其缺失信号肽的SIcDNA片段,构建酵母表达载体pYES2/S、pYES2/SI以及可表达SALI3-2-His6的pYES2/SH.空载体pYES2/ct和重组载体在转化酿酒酵母INVSC1后得到相应的酵母重组子INV/CK(对照菌)、INV/S、INV/SI和INV/SH.Westernblot实验结果表明,SALI3-2蛋白在酵母INVSC1中可被半乳糖诱导表达.对INV/CK、转基因的重组菌INV/S、INV/SI在无胁迫、含1.5mol/LNaCl或山梨醇培养基中的生长情况进行分析.结果表明,大豆SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达对无胁迫条件下酵母的生长没有影响,而在NaCl胁迫下可明显提高酵母转化子的耐盐能力.信号肽的缺失使SALI3-2蛋白的耐盐能力有所下降,可见信号肽对该蛋白耐盐功能的发挥有重要作用.另外,SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达不能提高酵母重组子的抗渗透能力,表明SALI3-2蛋白对细胞不具有明显的渗透胁迫调节作用.     

拟南芥肌醇- 1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA（AtMIPS1）,开放读码框为1533bp,编码510个氨基酸．与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86％-90％与95％-96％,并含有MIPS基因的保守区域“334SYNHLGNNDG”．将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a（＋）原核表达载体上,SDS—PAGE结果表明：在0．12g／LIPTG诱导2h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础．     

大豆PM2蛋白及其结构域可提高烟草耐盐性

深圳市微生物基因工程重点实验室已利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆PM2蛋白（LEA3）的耐盐功能，并首次证实PM2蛋白序列中的22-氨基酸结构域（PM2B）为一主要耐盐结构域．为在高等植物中进一步验证PM2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能，将大豆PM2及PM2B基因克隆至植物表达载体pB1121，并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘，通过PCR扩增法鉴定转基因植株．结果表明PM2及PM2B基因已整合至转基因烟草的基因组DNA中，转化率分别为44．4％和62．5％．与含1．5％（质量分数）NaCl的培养基比较，转基因烟草植株的生长状况和叶片的叶绿素含量，结果表明转PM2和PM2B基因的烟草耐盐性明显高于对照（转化pB1121载体）植株．这说明转PM2和PM2B基因可提高烟草的耐盐能力．可见，PM2蛋白及22-氨基酸结构域在原核和真核细胞中的耐盐保护作用可能是相似的．     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

利用数字表达谱分析拟南芥叶片中盐响应基因

为揭示拟南芥在盐胁迫下基因表达谱的变化,为解决盐害提出新的方向,以哥伦比亚野生型拟南芥为材料,利用数字表达谱技术(digital gene expression profiling,DGEP)分析盐胁迫组(200 mmol/L Na Cl处理2 h)和对照组的拟南芥叶片互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,c DNA)文库,鉴定盐胁迫下拟南芥中差异表达的基因.结果显示,盐胁迫组中共有4 400个基因发生了差异表达,其中,1 513个基因上调表达,约占34.39%;2 887个下调表达,约占65.61%.这些基因主要富集于22个基因本体(gene ontology,GO)条目,包括核糖体构成、细胞膜和细胞器组成、应答胁迫、脯氨酸代谢等过程.进一步的KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析表明,基础代谢、次生代谢以及光合和氧化代谢等32个通路的基因显著富集.此外,本研究筛选到6个显著差异表达的胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant,LEA)基因,其中,3个LEA基因在盐胁迫条件下上调表达,3个下调表达,暗示着这6个LEA基因可能是拟南芥在应答盐胁迫过程发挥关键作用的抗逆基因.     

SEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析

通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal entero-toxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列sec2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124sec2t,采用"珠磨法"将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10μg/mL Zeomy-cin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-sec2t.Southern blot和Western blot分析表明,sec2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-sec2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-sec2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生;与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.     

转C4型PEPC基因水稻非生物胁迫耐受性研究进展

作物在生长过程中会遇到很多非生物胁迫,如高温、高光强、干旱以及土壤盐碱化等,严重影响着作物产量潜力的发挥。水稻作为一半以上人类的主食以及模式植物,其对逆境信号分子的感受和响应作用机制一直是植物科学研究的热点之一。而高表达转玉米C_4型PEPC基因水稻显著增强了水稻的耐逆特性,作为表现耐逆优势的植物材料,在不同非生物胁迫有系列报道。文章对该水稻材料在形态、产量、生理生化及分子方面的变化特点以及其在响应非生物逆境下信号分子、转录因子、靶基因以及激素的作用机制等方面进行了总结,以期为进一步阐明水稻的耐旱机理提供参考依据。     

酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达

选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.61提升到0.85。在基因的5'端融合编码α信号肽序列,在3'端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶(AOX1)启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。     

基于植物p53保守序列构建RNAi的DNA片段方法

构建p53基因RNA干涉DNA片段的目的,是将其应用于植物悬浮培养中的细胞周期调节．依据拟南芥p53基因与其他高等植物具有高度保守区域的特点,合成其两个区域的核苷酸片段（Ⅰ和Ⅱ）及其相应的反向片段（Ⅰ＇和Ⅱ＇）,并在Ⅱ和Ⅱ＇端部分别引入内含子两个端部核苷酸序列．在相互连接后进行PCR选择扩增,其产物再与克隆裁体连接并经过蓝白斑筛选获得重组DNA;在电泳和核苷酸测序鉴定后表明,最终得到了Ⅰ-5＇-内含子-Ⅱ＇-Ⅱ-内含子-3＇-Ⅰ＇序列的重组DNA片段该片段两端含多克隆位点,通过插入植物的表达载体进入细胞基因组,在细胞中其转录产物将形成发夹结构,经胞内酶切后可以形成短的双链RNA片段,将具有干涉p53基因表达的功能     

在乳腺癌细胞MCF-7中紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2的表达

探讨紫杉醇在人乳腺癌细胞株MCF-7中诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达及与其诱导的相关途径．用不同浓度的紫杉醇刺激MCF-7细胞,MCF-7细胞生长受抑制．通过荧光实时定量PCR检测,发现紫杉醇刺激MCF-7细胞后硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达升高．经荧光素酶活性检测,得出紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2基因启动子活性的增高．p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂,SB203580抑制了紫杉醇诱导的硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达．因此,紫杉醇抑制MCF-7细胞生长,并通过p38丝裂原激活蛋白激酶途径诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达．     

阿科特素体外处理乳腺癌细胞的基因表达通路分析

近年来有研究表明黑升麻提取物阿科特素具有抗肿瘤活性。但其分子机制仍然不够清楚。研究用基因集富集分析的方法分析了20μg,／mL和40μg／mL两种不同质量浓度的阿科特素处理乳腺癌细胞MDA—MB--4536h或24h后的基因表达谱,获取处理后的乳腺癌细胞中的基因集富集情况．结果表明：处理6h的乳腺癌细胞中没有获得有统计学意义的基因集,而在处理24h的乳腺癌细胞中与细胞分裂、细胞周期等相关的生物学通路则表达下调,40Ixg／mL阿科特素处理还可以使得乳腺癌细胞中大分子降解相关通路表达上调．由于阿科特素可以促进细胞凋亡并抑制细胞周期,为其今后用于乳腺癌的预防和治疗的可能性提供了良好的理论依据．     

In Vitro Evaluation of Effects of Mg-6Zn Alloy Extracts on Apoptosis of Intestinal Epithelial Cells

We assessed the in vitro cytotoxicity of Mg-6Zn alloy and analyzed the cell apoptosis rate and the expression of caspase-3 to evaluate the effects of Mg-6Zn alloy extracts on apoptosis of intestinal epithelial cells(IEC)-6. IEC-6 cells were cultured in different concentrations of Mg-6Zn alloy extracts(40%, 20%) and in the control group. The indirect effects of Mg-6Zn alloy on IEC-6 cells were studied by calculating the cell relative growth rate(RGR), measuring the apoptosis of IEC-6 cells through flow cytometry, and investigating the expression of caspase-3 using real-time polymerase chain reaction. The experimental results show that the cytotoxicity of these extracts is Grade 0-1. The level of apoptosis in IEC-6 cells cultured in 40% Mg-6Zn alloy extracts is significantly higher than that in cells treated with 20% extract and the control group. The expression of caspase-3 is found to be up-regulated in the 40% extract as compared to 20% extract and the control group. Taken together, the data show that the Mg-6Zn alloy in 40% and 20% concentration extracts proves noncytotoxicity. But the 40% concentration of Mg-6Zn alloy extract can induce the apoptosis and the related caspase-3 expression in vitro.     

BKR基因启动子鉴定及表达调控

BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌中的一个重要的甾体化合物降解酶基因,Tet R、LysR和LuxR蛋白是睾丸酮丛毛单胞菌中的调控蛋白。以EGFP为报告基因,构建p K-BKR-EGFP质粒,通过与p K-EGFP分别转化到大肠杆菌JM109,检测荧光信号,确定预测的序列中包含BKR基因的启动子。然后通过质粒共转化技术,检测Tet R、LysR和LuxR蛋白与p K-BKR-EGFP的荧光信号强度,探讨Tet R、LysR和LuxR三个蛋白与BKR基因之间的调控关系。实验结果表明:BKR基因的启动子在该基因前699bp内;LysR与BKR基因共转后荧光信号增强;Tet R和LuxR分别与BKR基因共转后荧光信号减弱。由此可以得出结论,LysR对BKR基因的调控起增强作用;Tet R和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。该实验揭示了睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列,为CT菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础。