NtGGPPS4基因RNAi载体构建与功能分析

为研究NtGGPPS4在合成烟草萜类化合物中的功能,构建了该基因的RNAi表达载体pHellsgate2-NtGGPPS4,通过农杆菌介导法进行遗传转化。使用荧光定量PCR技术检测转基因烟株中NtGGPPS4的表达量,采用溶剂萃取法从转基因烟株中提取西柏三烯醇和质体色素,并分别使用GC-MS、LC-MS测定其含量。结果表明,在NtGGPPS4表达量明显下降的转基因烟株中,α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、新黄质、紫黄质、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的含量明显下降。表明NtGGPPS4参与调控了烟叶中西柏三烯醇和质体色素的生物合成。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

利用VIGS技术研究NtbHLH93基因在烟草甾醇代谢中的功能

为进一步研究烟草NtbHLH93基因的功能,利用病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silence,VIGS)技术降低烟草中NtbHLH93基因的表达。通过测定pTRV2-NtbHLH93烟株中的甾醇含量,发现NtbHLH93基因表达下调后,总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。转录组测序发现NtbHLH93基因下调后,共有259个基因差异表达。对这些差异表达基因进行KEGG表达通路分析,发现质体萜类代谢2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate, MEP)途径中有两个基因(Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1)上调表达,这两个基因与MEP途径中的牻牛儿基牻牛儿基还原酶(Geranylgeranyl diphosphate synthases, GGPPS)基因序列高度相似,推测当甾醇合成代谢通路受阻后导致Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1基因上调表达。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽叶茎根。     

不同品种烤烟鲜叶表面提取物的主要成分分析

选择贵州省4个主要烟草品种,分下、中、上3个部位采收成熟鲜叶,用二氯甲烷提取叶表面物质进行分析检测。结果表明,烤烟鲜烟叶表面提取物主要包括烟碱、酮类、萜烯类和烷烃类。烟碱含量最高,酮类含量甚微。萜烯类物质是烟草叶表面提取物的主要成分,主要是西柏烷类,包括西柏烷、西柏三烯一醇和西柏三烯二醇。西柏三烯二醇含量高于西柏三烯一醇,β-西柏三烯醇二醇含量较α-西柏三烯醇二醇稍多。烷烃类主要是三十烷以上的高级烷烃,含量较多。不同品种鲜叶表面提取物总量存在明显差异,南江3号最低,K326次低,贵烟201较高,云烟85最高。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

烟草α-西柏三烯二醇的分离及抑制HepG2细胞活性研究

为挖掘烟草中α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(α-CBD)在抗肿瘤活性方面的应用价值,从烟花中提取并分离获得α-CBD,以Hep G2肿瘤细胞为材料,在体外培养条件下,分别应用噻唑蓝(MTT)法、集落形成试验和吉姆萨染色法研究了不同质量浓度(2.5~80 mg/L)的α-CBD对Hep G2细胞增殖、生长和形态变化的影响。结果发现,α-CBD具有抑制Hep G2细胞株增殖、降低细胞克隆形成并使细胞呈现凋亡形态的作用。说明烟草α-CBD具有抑制肿瘤细胞生长的活性,具有深度开发利用价值。     

不同基因型烟草腺毛主要分泌物差异分析

为明确不同基因型烟草腺毛分泌物的成分差异,筛选高腺毛分泌物基因型的烟草种质,本研究基于气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）,对不同基因型的12个烟草品种的鲜烟叶腺毛主要分泌物进行鉴定分析,结果表明:在12份检测品种烟叶中,西柏三烯二醇（CBT-diols）是西柏烷二萜的主要物质形式,且其在烤烟品种中含量相对较高;所有检测品种中均含有α-西柏三烯二醇（α-CBT-diols）和β-西柏三烯二醇（β-CBT-diols）,两者比值变化范围为1.58~2.32;所有检测品种中共检测出5个蔗糖酯类型,可依据蔗糖酯类型的有无和含量的多少将检测种质分为Ⅰ-Ⅱ型蔗糖酯较多和Ⅲ-V型蔗糖酯较多2个大类。总体上看,Basma、Beinhart1000-1、红花大金元、BX1、BX2这5个品种腺毛主要分泌物含量较高,可供烟草香气品质改良育种或表面活性物质提取利用。      

我国烟草资源西柏三烯二醇含量分析

  目的  了解我国烟草资源腺毛分泌西柏三烯二醇含量特征。  方法  用超高效液相色谱（UPLC）法测定并分析了不同器官、叶位以及不同烟草类型、品种间西柏三烯二醇特征。  结果  （1）同一生长时期,烟花中西柏三烯二醇均高于其他器官;随叶位升高,烟草叶片西柏三烯二醇均呈升高趋势。（2）540份烟草种质均检测到西柏三烯二醇;烤烟西柏三烯二醇含量最高,其他类型烟草差异不显著,不同类型烟草α与β-西柏三烯二醇异构体的比值也存在差异;（3）筛选了富含西柏三烯二醇（大于2%）的烟草种质28份,其最高含量达3.46%。（4）根据特色烤烟品种红大及香料烟品种沙姆逊分析结果,西柏三烯二醇含量差异是烟草香吃味品质差异的重要化学成分基础。      

不同晒晾烟品种西柏烷二萜醇的研究

为客观评价不同晒晾烟品种的西柏烷二萜醇含量,采用气质联用法对6个不同地区11个晒晾烟品种的西柏烷二萜醇含量进行了检测与分析。结果表明:(1)不同品种之间的西柏烷二萜醇含量大小顺序为枇杷叶> 杨梅烟> 黑烟> 寸三皮> 麻阳红> 小柳叶> 烤烟> 二黑烟> 马耳烟> K16> 黑老> 公会晒烟,并通过聚类分析将11个晒晾烟品种分成了高含量、中含量和低含量三类。(2)不同类型晒晾烟的西柏烷二萜醇含量大小顺序为浅晒红烟> 晒红烟> 深晒红烟> 晒黄烟。(3)不同部位之间,除马耳烟外,其余品种西柏烷二萜醇含量均表现为中部叶大于上部叶。(4)通过线性相关分析发现,α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇与β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇的含量存在一定的线性相关性,决定系数(R²)为0.9576。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析

为明确柯巴基焦磷酸合酶基因(CPS2)的功能和调控机制,利用CRISPR/Cas9技术对高香气烤烟品系8306中的CPS2基因进行定向编辑,得到了7株靶位点单碱基A/T/C插入的转化植株。利用q-PCR技术分析转化植株二萜类关键基因的表达,并利用GC/MS分析叶面分泌物成分及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)含量(质量分数)。结果表明:(1)T0代转化植株CPS2及ABS表达量显著降低,冷杉醇和赖百当烯二醇含量也显著降低。(2)DXR表达量均显著升高,GGPP含量也大幅提高。(3)CYC-1和CYP71D16表达量差异较大,西柏三烯二醇出现小幅降低。(4)T0代转化植株的株高、茎围、叶间距、最大叶长、最大叶宽均增加。因此,敲除CPS2能够抑制赖百当类化合物合成,有助于上游途径中萜类合成前体GGPP的积累,可能抑制西柏三烯二醇积累,同时使植株表型性状发生变化。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

为研究烟叶中的萜类成分含量(质量分数),采用选择反应监测模式,建立了同时测定新鲜烟叶中反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(α-CBD)、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(β-CBD)、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸等21种萜类成分的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)方法;并采用该方法对云南、河南、贵州等3个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析。结果表明:在线性范围内21种萜类成分的R2为0.999 0～0.999 8;方法检测限为12.7～308.7 ng·g~(-1),定量限为35.8～984.6 ng·g~(-1);日内、日间精密度(RSD)分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%。不同产区烟叶中主要萜类成分α-CBD的含量高低顺序为云南(98.83μg·g~(-1))河南(57.04μg·g~(-1))贵州(38.61μg·g~(-1)),且3个产区之间存在显著性差异。贵州产区烟叶中萜类成分含量的分布较云南和河南产区烟叶差异更大,遵义种植的南江3号品种烟叶中萜类含量与其他3个品种差异明显。该方法前处理简单,分析的萜类物质覆盖面广,可用于批量烟叶样品的检测。     

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

超高效液相色谱法测定烟草西柏三烯二醇

建立了超高效液相色谱-紫外检测(UPLC-UV)外标法定量测定烟草α和β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇的方法。烟草样品以乙酸乙酯为萃取剂,液料比为50:1,在超声频率45 k Hz,提取温度为25~30℃,提取时间10 min条件下进行目标化合物提取,提取液经氮气吹干,用流动相溶解,以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)为分离色谱柱,以70%乙腈为流动相,流速为0.3 m L/min,柱温为35℃,在波长为200 nm条件下进行检测。结果表明,α和β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇线性范围分别为12.14~194.2、6.229~99.67μg/m L,仪器检出限分别为0.1166、0.1495μg/m L,方法定量限分别为33.8、49.8μg/g,在3个加标浓度下,平均回收率分别在96.7%~98.8%、96.2%~98.4%,方法重现性相对标准偏差分别为3.46%、3.11%。本方法与行业标准相比,对烟草西柏三烯二醇的测定结果无显著差异。该方法操作简单、溶剂用量少,检测周期短,精密度和准确度均较高,适用于烟草α和β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇批量检测。     

外源MeJA诱导烟草叶面防御反应

以中烟100为材料,研究了茉莉酸甲酯(MeJA)喷施后,烟草叶面腺毛密度类型、腺毛分泌物合成积累及叶片对蚜虫抗性的变化规律,探讨了烟草叶面腺毛的防御反应模式和作用机制。结果表明,MeJA处理后,烟草叶片对蚜虫的驱避作用明显增强,新生叶片叶面腺毛密度增加,尤其是长柄多细胞腺头腺毛密度的变化达到显著水平。GC/MS分析表明,MeJA处理使叶面分泌物含量增加,并在处理后第7天达到最大值。其中,西柏烷类二萜化合物含量增幅最大。但RT-PCR分析发现,西柏三烯一醇合成酶基因(CBT)、西柏三烯一醇羟化酶基因(CYP71D16)在转录水平上并没有明显变化,表明烟草叶面腺毛物质的合成和分泌可能具有复杂的转录后调控机制。     

不同品种（系）烤烟西柏三烯二醇代谢差异及其对香气品质的影响

摘要:研究了不同烤烟品种（系）叶面分泌物组分以及主要成分西柏三烯二醇的代谢差异,并对烟叶感官质量进行了评价,以期初步阐明烟草西柏三烯二醇代谢机理并为寻找和选育烟草中具有特异香气的种质资源提供有效的研究方法。本研究采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分别测定了8306、12451、云烟87、Y892×8306、豫烟11号、NX232和中烟100,7个烤烟品种（系）中部叶龄60d叶面分泌物组分,并对其中差异较大的8306、12451和云烟87的西柏三烯二醇合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16进行了荧光定量PCR测定,对成熟期叶面分泌物的变化、调制后烟叶茄酮含量和感官质量进行了分析评价。结果表明,7个烤烟品种（系）中部叶叶龄60d时烟叶的叶面分泌物中,共测定出13种非挥发性化合物,主要成分为西柏三烯二醇,材料间含量存在差异;8306具有最高的叶面分泌物和西柏三烯二醇含量,豫烟11号次之,12451最低;CYC-1和CYP71D16在8306中的相对表达量显著高于12451和云烟87,说明这两个基因的上调表达促进了西柏三烯二醇的合成。成熟期具有较大西柏三烯二醇降解量的8306和豫烟11号在调制后拥有更高的茄酮含量;与云烟87相比,豫烟11号获得了较高的感官评吸分数和工业评价。      

烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。     

转OjDREB基因提高烟草耐盐能力的研究

利用农杆菌介导法将沿阶草OjDREB基因转入烟草植株中.通过RT-PCR检测,获得转OjDREB基因的烟草植株.以400 mmol/L NaC1处理转基因烟草植株和野生型对照10 d后,结果显示:转基因烟草体内叶绿素含量和SOD酶活性是野生型对照的16.98倍和1.91倍;体内的MDA含量和电解质渗透率分别是野生型对照的59.23％和55.07％,说明过量表达OjDREB基因可以提高烟草的耐盐能力.     

典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

以烟草品种K326为材料,分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川三个典型生态区,在烟草叶片发育过程中对叶面腺毛形态、密度、腺毛分泌物及基因表达水平进行了比较研究。显微观察发现腺毛类型在3个地区间变化不大,都以长柄多腺头腺毛为主,但腺毛密度以贵州遵义产区的烟叶最高,河南次之,云南最低;GC/MS检测表明,西柏三烯二醇含量以河南产区为最高。且河南和云南产区随叶龄变化趋势相同;RT-PCR分析表明,西柏烷类化合物合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16转录水平的表达与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。该研究表明生态环境对烟草腺毛发育和物质代谢具有较大影响,典型生态区烟叶叶面化学的差异可能与烟叶的风格特色密切相关。