黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉XZ-3S中扩增并克隆了木聚糖酶(Xyn ZF-1)基因的cDNA片段,测序结果表明,Xyn ZF-1基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,推测分子量为24.06ku,等电点为5.20。以XZ-3S基因组DNA为模板扩增Xyn ZF-1的DNA序列,该序列仅存在一个内含子,长度为68bp。成熟肽基因推导的氨基酸序列与其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较,同源性最高达到了89.47%。系统进化树分析该酶属于G/11族糖基水解酶。又进一步对Xyn ZF-1二级结构进行了分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

大蒜果聚糖水解酶全长cDNA的克隆

采用PCR和RACE的方法,获得大蒜果聚糖水解酶(FEH)基因的全长cDNA序列,并对其基因结构和系统进化进行分析。结果表明,所获得的cDNA序列全长1900bp,开放阅读框(ORF)为1668bp,编码555个氨基酸。在该氨基酸序列中发现已知FEH氨基酸序列的保守功能域;与小麦(Triticum aestivum)、黑麦(Lolium perenne)的FEH氨基酸序列的同源性为53%。基本确定首次获得了大蒜FEH基因。      

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

红花菜豆黄烷酮-3-羟化酶基因电子克隆及序列分析

黄烷酮-3-羟化酶(F3H)是植物类黄酮物质生物合成途径中的一个关键酶。本文利用电子克隆的方法,采用已经报道的大豆F3H基因cDNA序列为种子序列,搜索红花菜豆EST数据库,获得了假定的红花菜豆F3H基因cDNA的序列。根据假定的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR的方法获得了红花菜豆F3H基因cDNA的编码序列。并采用生物信息工具对红花菜豆F3H的性质包括氨基酸序列组成、物理和化学性质、二级和三级结构的特点进行了研究。结果表明,红花菜豆F3H基因cDNA包含一个1128 bp的完整的开放读码框,其编码蛋白由375个氨基酸组成。与大豆黄烷酮-3-羟化酶同源性为92%。其二级结构含有40.8%α螺旋和39.73%无规则卷曲,β折叠较少为4.53%。采用同源模建的方式分析其三维立体结构,表明其三维结构是一个紧密的球状结构。     

黑芥ANS基因的克隆和在芸薹属B基因组的PCR鉴别

利用同源克隆方法克隆黑芥ANS基因,获得2个ANS基因拷贝BnANS1和BnANS2,长度分别为1 366bp和1 367bp.这2个基因都有1个76bp的内含子.比较BnAⅣS1和BnANS2基因序列,发现在编码区、5＇与3＇非编码区和内含子区域都有多态性,5＇非编码区有3个碱基的多态性和4个碱基的缺失,编码区有26个碱基的多态性;内含子有2个碱基的多态性;3＇非编码区有18个碱基的多态性和3个碱基的插入.这2个ANS拷贝都编码356个氨基酸的蛋白,具有其他物种同样的ANS蛋白保守结构域,属于2OG-Fe（Ⅱ）加氧酶超家族.BnANS1编码的蛋白质理论分子量为40 448.58Da,等电点为5.05;BnANS2编码的蛋白质理论分子量为40 468.52Da,等电点为5.04.比较这2个ANS基因拷贝编码的蛋白质序列,发现有9个多态性位点.这2个ANS拷贝在黑芥的种皮和胚中均检测到表达.获得了1对ANS引物,能从白菜、黑芥、甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中,用等位特异PCR方法特异识别来自芸薹属B基因组的ANS基因.     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

烟草钾离子通道基因NKT5的克隆和序列分析

本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草钾离子(K~+)通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得其3'和5'末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K~+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5'端非编码区190bp、3'端非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明其在烟草吸钾及抗逆过程中的功能及分子机制奠定了基础。     

南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据GeneBank中公布的GGPPS基因保守区设计特异引物,克隆南方红豆杉GGPPS基因的DNA和cDNA序列,并通过生物信息学方法对其核苷酸序列和蛋白质结构进行分析预测。结果表明,GGPPS基因DNA和cDNA序列都为1 182 bp,DNA序列中无内含子,cDNA序列为一个编码393个氨基酸残基的开放式阅读框;GGPPS的理论相对分子质量为42 590,等电点为5.68。核苷酸同源性分析显示,它与Taxus canadensis(AF081514)同源性为98.8%;推导出的氨基酸序列与Taxus canadensis(AAD16018)同源性达99.0%。利用Protparam、SignalP、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling、Scan Prosite和MEGA4.0等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构、三级结构和进化树进行分析,为其功能研究和生物合成紫杉醇研究提供分子基础。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究

采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。     

三个烟草防御素基因的克隆及序列分析

为从烟草中克隆与植物抗病虫反应相关的防御素基因, 以辣椒防御素基因为探针, 通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中克隆到3个防御素基因(NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3), 并对其进行了序列分析。结果表明, 3个防御素cDNA序列均包含完整的开放读码框, 分别编码78、77、76个氨基酸, 具有8个半胱氨酸的高度保守结构等典型的植物防御素特征, 成熟肽含有γ-硫素蛋白功能结构域。通过同源比对和进化分析发现, NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3的氨基酸序列与辣椒的一致性最高为50%~87%, 亲缘关系较近;但与已报道的烟草属植物防御素的一致性仅为33%~40%, 亲缘关系较远, 表明NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3是烟草中未报道的3个防御素基因。     

GASA基因超家族新成员——烟草抗菌肽基因的克隆及序列分析

抗菌肽可以增强植物对病原微生物的抵抗能力,本研究利用生物信息学方法,获得了烟草品种K326的3种抗菌肽cDNA序列(NtSN1a、NtSN16和NtSN2a),并对其进行了序列分析.结果表明,3种抗茵肽cDNA序列均具有完整的开放读码框,NtSNIa和NtSNIb均编码88个氨基酸,NtSN2a编码104个氨基酸.对推导的氨基酸序列分析发现,它们都具有典型的GASA基因超家族保守结构域,属于GASA基因超家族成员.系统进化分析表明,NtSN1a和NtSN16与马铃薯抗菌肽snaking-1聚为一类,NtSN2a与马铃薯抗菌肽snaking-2聚为一类.这些结果为进一步研究抗菌肽基因的抑菌效应,比较其在烟草抗病防御反应中的作用奠定了基础.     

宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其三维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化三联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。     

普通烟草WDR基因的克隆与序列分析

在烟草腺毛的发育中,WD40-bHLH-MYB复合体起着重要的调控作用。利用RT-PCR从云烟85中克隆得到一条普通烟草(Nicotiana tobacum)WDR(NtWDR)全长cDNA序列,GeneBank登录号为GQ260131。NtWDR基因cDNA全长1433bp,具有一个1029bp的开放阅读框(ORF)、一个147bp的5′非翻译区和一个257bp的3′非翻译区。该基因编码一个342aa的蛋白质,预测的分子量为38.49kDa,等电点为4.81。BLASTs和NCBI保守域收索表明,NtWDR是AN11/TTG1型WD40蛋白。系统进化和结构特征分析表明,NtWDR基因是PhAN11和Le113964R基因的垂直同源基因。     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。