耐辐射球菌PprI蛋白质表达及其纯化的实验研究

为了在大肠杆菌中高效表达耐辐射球菌PprI融合蛋白并进行纯化,本研究以PCMV-HA-pprI质粒为模板,PCR扩增pprI基因全序列,经NcoI和EcoRI双酶切后定向克隆到pET-28a表达载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转入E.coli BL21(DE3)RP.IPTG诱导融合蛋白...     

耐辐射球菌Deinococcus radiodurans辐射抗性的研究进展

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）是迄今为止发现的对电离辐射、紫外线、过氧化氢等一些DNA损伤剂都具有极强抗性的微小球菌，研究表明，这种独特抗性归因于其具有高效而准确的DNA修复系统。公认的耐辐射球菌有3种DNA修复方式：碱基切除修复、核苷酸切除修复和重组修复。对于耐辐射球菌是否具有SOS易错修复尚存争议，染色体DNA的降解和排除细胞外有利于DNA修复的正确和顺利进行，但DNA修复过程的分子柚是了解却甚少。     

耐辐射奇球菌的辐射损伤修复机制研究进展

耐辐射奇球菌是地球上目前发现的最耐辐射的生物之一,它对于电离辐射、紫外线、H2O2以及其他一些因素所导致的DNA和蛋白质的损伤都具有极强的耐受与抵抗能力。目前已知耐辐射奇球菌的高效DNA损伤修复能力是其具有超强辐射抗性的关键,但是对于该修复能力的具体作用机制,目前尚未有定论。本工作将就耐辐射奇球菌DNA辐射损伤修复主要机制研究进展作一综述。     

骨形成蛋白对小鼠造血型急性放射损伤治疗作用的研究

小鼠经^60Coγ射线6．5－7．5Gy照射后,分别于肌袋内植入纯化牛BMP,或腹腔内注入可溶性rhBMP-2m,或移植Pbk-hBMP-2/NIH3T3人腹腔内,观察动物的30d活存情况,并检测几种造血参数。结果表明,pbBMP（纯化牛骨形成蛋白）、hBMP-2m(重组骨形成蛋白－2多肽）Pbk-BMP-2/NIH3T3 cell line(PBKhBMP-2转基因细胞株）对小鼠6．5、7．0、7．5Gyγ射线照射后急性放射造血损伤有治疗作用：GM－CFU集落形成率、各项造备参数和30d活存率均较对照组有显著性差异（P＜0.01)。本工作结果提示,BMP对成年动物放射所致造血损伤具有治疗作用,其机理与促进已损伤的造血功能的修复作用有关。     

FL对辐射所致小鼠多脏器损伤的防护作用

采用6.0Gy^60Coγ射线一次全身照射BALB/C小鼠，分别于照前和照后不同时间给予FL或与其他细胞因子G-CSF、IL-11和EPO联合应用，观察其对小鼠外周血细胞计数的影响，以及使用这些细胞因子后受照小鼠心、肝、肾、肺、脾、胸等脏器的组织病理学改变。结果表明，在照前2h给予FL，能加速小鼠外周血细胞尤其是白细胞的恢复，并可减轻照射所致小鼠心、肝、肾、肺、脾、胸腺等脏器的损伤。     

耐辐射奇球菌对铀的富集性能及其对pH动态调节研究

探索耐辐射奇球菌在不同时间、不同菌剂量、不同初始铀浓度、不同溶液pH下对铀的富集条件以及对铀溶液的pH调节;通过红外光谱和扫描电镜表征其富集机理。结果表明：富集铀的最佳富集时间为60 min、最佳菌剂量为10 mL(当OD₆₀₀为1时的菌液量)、最佳铀初始质量浓度为30 mg/L、最佳pH为5.0;在不同pH的铀溶液中富集后,溶液pH都略有上升;红外光谱仪和扫描电镜结果显示,耐辐射奇球菌富集前后菌体的多个活性官能团和形貌都发生了变化。耐辐射奇球菌对低浓度铀溶液的富集性能较好;对铀溶液pH有调节作用,使富集后的铀溶液pH上升。     

耐辐射奇球菌未知功能基因DR_2566的克隆与生物信息学分析

克隆与辐射抗性相关但功能未知的新基因DR_2566,并应用生物信息学初步探讨其功能。应用PCR技术从耐辐射奇球菌基因组中扩增DR_2566基因全长ORF,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过限制性酶切及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能。成功克隆了耐辐射球菌未知功能基因DR_2566,生物信息学分析显示此基因全长为507 bp,编码168个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为19.136KDa,三级结构预测显示DR_2566蛋白质具有短修复内切酶性质。成功克隆了耐辐射奇球菌基因DR_2566全长ORF,生物信息学预测DR_2566蛋白可能具有错配修复作用。     

抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究

为研究抗辐射球菌pprI基因活体电转染对哺乳动物急性放射损伤的影响,探讨一种新的救治放射损伤的转基因技术。将自行构建的pCMV-HA-pprI质粒注入接受γ射线照射的小鼠肌肉内,采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,观察照后第1、7、14、28和35天小鼠死亡率、血细胞计数以及骨髓细胞、脾脏和胸腺淋巴细胞凋亡的变化。结果显示,6Gyγ射线可引起小鼠急性致死性放射损伤,转基因组小鼠死亡率(1/10)明显低于单纯照射组小鼠死亡率(4/10)。与单纯照射组和空载体转染组比较,pprI基因转染组小鼠外周血白细胞总数及红细胞总数于照后第7天显著增高(p0.05);血小板数于第7、14天显著增高(p0.05);血淋巴细胞百分率于照后35天恢复正常;pprI基因转染组脾细胞凋亡率于第7、14、28天显著降低(p0.05);胸腺细胞凋亡率于第1、7、14、35天显著降低(p0.05);骨髓细胞凋亡率于第1、7、14和28天显著降低(p0.05),并且胸腺细胞和骨髓细胞凋亡率均于照后28天恢复正常。结果表明,抗辐射菌pprI基因活体电转染对动物急性致死性放射损伤具有明显的防治作用。     

耐辐射奇球菌DR_2327和DR_2328基因克隆及功能分析

通过生物信息学分析耐辐射奇球菌DR_2327和DR_2328基因及编码蛋白的基本性质,利用PCR方法克隆DR_2327和DR_2328的全基因,连接至p GEM-T载体上,转化至大肠杆菌JM109中,并进行双酶切鉴定。生物信息学分析结果表明,DR_2327和DR_2328基因位于同一操纵子中,且DR_2328蛋白具有组氨酸激酶活性,DR_2327蛋白具有反应调节子功能,提示两者很可能组成一对双组分系统。体外实验表明,DR_2327和DR_2328基因的外源表达在一定程度上提高了大肠杆菌对紫外辐照和H2O2的耐受能力。     

耐辐射奇球菌pprI和pprA基因在真核细胞293T中的表达

以pGADT-7-pprA、pet28a-pprI载体为模板,构建pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI真核表达载体,脂质体2000介导将两个重组载体共转入293T细胞。双酶切及琼脂糖凝胶电泳显示在4700、1000 bp处与4800、1100 bp处出现目的条带。测序结果显示构建序列与模板序列一致,氨基酸序列100%正确。荧光显微镜下见到红色和绿色荧光;Western blot结果显示在不同检测水平65 kDa及60 kDa大小处有融合蛋白表达。结果提示pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI真核表达载体构建成功,并在离体293T细胞中共同表达蛋白。证明原核基因pprI、pprA能够在真核细胞中共表达,为后续实验验证DR菌高抗性基因pprA、pprI及其产物在辐射调控网络中的相互作用和协同作用、提高真核细胞的辐射抗性提供了研究基础。     

生理浓度的活性氧对抗辐射菌的影响

本研究探讨了生理状态下抗辐射菌(Deinococcusradiodurans,DR)内活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)的释放;生理状态下释放的ROS在DR增殖中的作用;以及受不同剂量照射下ROS的释放及其作用的改变。受电离辐射后DR的O2释放随着剂量的升高而增加,并在700Gy时达到最高值,当剂量超过1kGy.-时O2释放即迅速下降,加入二亚苯基碘(Diphenyleneiodonium,DPI)后,O2释放显著降低,且照射.-.-后O2的释放均未超过对照组。.-受照后DR的增殖率随剂量的增大而上升,剂量为1kGy时增殖率达到最高点,而剂量超过1kGy时增殖率迅速下降;达3kGy时增殖率低…     

抗辐射菌lexA基因对受γ射线照射和MMC作用的大肠杆菌敏感性的影响

研究抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中的表达对其γ射线辐射抗性和丝裂霉素(MMC)敏感性的影响。应用电穿孔技术将携带有抗辐射菌lexA基因的重组质粒PZA172转入大肠杆菌JM109，其启动子为lacZ，用异丙基-硫代-β—D半乳糖苷(IPTG)诱导，(十二烷基磺酸纳)聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳检测LexA蛋白的表达。经受不同剂量γ射线照射和不同浓度的MMC作用，平板菌落计数，绘制存活曲线。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中，经IPTG诱导能稳定地表达，lexA基因的显著表达降低了大肠杆菌经γ射线照射和MMC作用后的存活率。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌中的显著表达降低了大肠杆菌对γ射线和MMC的抗性，其作用机理还有待于进一步的研究。     

耐辐射奇球菌pprM DNA结合域功能分析预测与基因敲除重组体的构建

通过生物信息学分析发现,pprM基因含有冷休克DNA结合域。利用Overlap PCR方法获得pprM基因DNA结合域缺失的基因片段pprMACSD后,酶切扩增的片段和自杀质粒空载体pkl8mobsacB,并将目的基因片段与自杀质粒载体连接构建重组载体pkl8mobsacB-pprMACSD,将重组子转化大肠杆菌JM109感受态,筛选出阳性克隆,酶切及测序鉴定。成功构建pprMDNA结合域基因敲除重组体,且生物信息学分析预测结果显示pprMDNA结合域与耐辐射奇球菌抗辐射功能相关。     

Proteomic analysis of the gene DR1709 mutant in Deinococcus radiodurans

DR1709 is a predicted Mn~(2+) transporter in Deinococcus radiodurans(D.radiodurans). The mensuration method to evaluate protein viability with two-dimensional electrophoresis in D.radiodurans and the mutants was established in this study. The results showed that after DR1709 was disrupted, the expressions of DR1120(acetokinase), DR1691 (heat shock protein), DR1485 (putative lipase), DR2095 (putative c-type cytochrome) and other three hypothetical proteins (DR0124, DR0047 and DR2474) were repressed. However the expression of DR1794 (putative nosX) was induced. Phenomena above suggested that the increased radiation-sensitivity of the mutant cells may be attributed to not only the protection of gene DR1709, but also the proteins' different expressions between the wild type and the mutant might also play important roles in protecting D.radiodurans from irradiation.Although DR2095 was a homologue of c-type cytochrome, it has no realitic functions.     

抗辐射菌Deinococcus radiodurans的DNA结合蛋白的检测及分析

抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ是微小球菌属的一种,它对电离辐射、紫外线及其他的化学诱变剂所诱导的ＤＮＡ抽伤都具有极强的修复能力,故倍受放射生物学界的关注。本研究旨在检测抗辐射菌的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉ,ＤＢＰ）,并有选择地对其氨基酸序列加以分析,以进一步研究ＤＢＰ在抗辐射菌的辐生中的作用和意义。主要研究方法：分离提取抗辐射菌染色体ＤＮＡ并用地高     

Effect of N+ beam exposure on the activities of Mn-SOD and catalase in Deinococcus radiodurans

1 INTRODUCTIONBacteria Deinococcus, formerly a part of Micrococcus[1], are the types of a smallnUmber of exceptionally radiation-resistant, red-pigmented cocci considered to compriseone of the eight major groups of the enbacteria. These bacteria share high resistance toboth the lethal and mutagenic effects of ionizing and ultraviolet (UV) radiation. Mosto f the studies on the radiation resistant mechanisms of D.radiodurans mainly focusedon D.radiodurans RI[2-5]. Extensive investigation…     

超氧化物歧化酶与阿米福汀对小鼠急性放射损伤预防作用的比较

本研究建立了小鼠全身放疗的损伤模型,以比较预给药超氧化物歧化酶(SOD)和阿米福汀对小鼠放射治疗损伤的防护效果。C57BL/6小鼠用6 Gy X射线进行全身一次性照射,在放射后24 h处死,测定小鼠外周血红、白细胞数量,胸腺指数和脾脏指数,以及肝脏抗氧化活力。结果表明:与放疗对照组相比,放疗前给药SOD组对放疗鼠的外周血白细胞数量和胸腺指数有显著的保护作用,使之分别增加66.7%和19.1%。测得放疗前给药阿米福汀对放射鼠的外周血白细胞数量和脾脏指数有显著的保护作用,使之分别增加106.9%和22.6%。此外,与放疗对照组相比,放疗前给药SOD对放疗鼠的肝脏抗氧化能力也有显著提高,可使肝脏的MDA水平下降12.7%,SOD活力增加10.8%,T-AOC活力增加45.0%,放疗前给药阿米福汀可使放疗鼠肝脏的MDA水平下降22.3%。