gldABC基因与dhaT基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1．1736的基因组DNA为模板，通过基因扩增仪（PCR）扩增得到了目的基因（g1dABC）并将该基因克隆到pMD19-T Simple载体。通过对该基因的序列分析，甘油脱水酶（g1dABC）结构基因的全长为2816bp。将限制性内切酶处理后的含有自身核糖体结合位点的dhaT基因插入到质粒pMD19-T Simple／g1dABC中g1dABC基因的下游，形成重组克隆质粒pMD19-T Simple／g1dABC-dhaT，并进一步将g1dABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a（＋）上。     

甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达

将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游,形成重组克隆质粒pMD19TS3,进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT 2h,SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1,3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42 ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶30.4 U/mL。     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌（既cherichia coli）中扩增出1．16kb的编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，将其连接到温控表达载体pHsh，得到重组哉体pHsh-yqhD，重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示：融合表达产物的相对分子质量均为43000，同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yghD的基因工程菌进行表达研究表明：42℃诱导4h，1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100IU／mg，而对照菌株的酶活力仅为0．5IU／mg。     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶酶活分析方法研究

有氧条件下,建立了克雷伯杆菌破碎方法及其生产1,3-丙二醇代谢途径中关键酶酶活测定方法。超声波细胞破碎优化条件为:超声频率30kHz,100%振幅,间歇频率0.6,超声时间12min。细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶酶活测定的最适pH分别为12、9.5和7.0,最适温度分别为45oC、45oC和37。甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶用初速度法测定。甘油脱水酶用终止法测定。     

甘油脱水酶结构基因(gldABC)克隆及序列分析

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(gldABC)并将该基因克隆到pMD19-TSimple载体。通过对该基因的序列分析,甘油脱水酶(gldABC)结构基因的全长为2816bp,由三个独立的开放阅读框架组成,三个独立的读码框分别由1668、585、426bp组成,分别编码556、195、142个氨基酸。通过BLAST同源性分析,该基因与GenBank中已发表的gldABC基因(U60992)的核苷酸序列同源性为99.39%。氨基酸的同源性为100%。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

大豆过氧化物酶基因的克隆及其表达载体的构建

大豆过氧化物酶(soybean peroxidase,sbp)基因的克隆及其表达载体的构建将有利于人们更深入的从分子生物学角度研究sbp 基因的结构与功能。首先从大豆根中获取总RNA,通过RT-PCR 获得sbp 基因。再将sbp 基因与表达载体pPICZα-A 双酶切后连接,构建重组表达载体pPICZα-A-sbp。将pPICZα-A-sbp 转化大肠杆菌筛选阳性克隆体并测序。结果表明：获得的sbp 基因序列与已报道的sbp[U51191(GmEpa1)]基因序列有92% 的同源性。重组表达载体pPICZα-A-sbp 的成功构建为其在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。     

高温超氧化物歧化酶基因的克隆及真核重组转移载体pVL-sod的构建

从高温塘泥中分离得到一株耐高温菌株,推定其属于Geobacdlus属,根据该属已知的超氧化物歧化酶基因(sod)序列,用PCR的方法扩增得到该菌的sod基因.序列分析表明,该基因全长1236bp,编码411个氨基酸.本试验构建了用于家蚕杆状病毒表达的重组转移载体pVL-sod,为下一步在家蚕杆状病毒中高效表达超氧化物歧化酶奠定了基础.     

抗菌肽Japonicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上，经PCR鉴定及序列分析，所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap，结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

肺炎克雷伯氏杆菌二羟丙酮激酶基因(dhaKL)克隆与表达

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组为模板,通过PCR技术成功地扩增了dhaKL基因,并构建了pET-28a(+)/dhaKL表达载体。DNA序列分析的结果表明:dhaKL基因由2个开放阅读框架组成:ORF1全长为1017bp,编码356个氨基酸;ORF2全长633bp,编码210个氨基酸。SDS-PAGE电泳结果表明:dhaKL基因获得了有效表达,上清液中的酶活性为15.6U/mL。     

具纤溶活性菌株ND2的筛选及其纳豆激酶基因的克隆、表达

从市售的纳豆制品中分离并纯化出一株具有高效纤溶活性的菌株ND2,经生理生化特性及16SrRNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。通过正交试验优化菌株ND2的发酵条件,得到ND2产纳豆激酶的最佳条件:氮源-大豆蛋白胨,碳源-淀粉,碳氮比3:1,37℃,pH6.0。经PCR扩增得到825bp的纳豆激酶成熟肽基因,采用pET32a(+)表达载体和BL21(DE3)为宿主菌,在温度为37℃、1‰IPTG浓度下可诱导获得较高表达量的重组纳豆激酶。     

产1,3-丙二醇菌株的筛选、改良及发酵

从自然界筛选得到了9株可发酵甘油生产1,3 丙二醇的肠道细菌,经鉴定均为肺炎克雷伯氏菌.经化学诱变,菌株的1,3 丙二醇产量有所提高,其最终产量达到2%左右.     

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)是番茄红素合成的关键酶,本研究通过PCR 法获取pds 基因和E8 启动子序列,将目的基因和E8 启动子序列构建到植物表达载体pMD1 中,构建了含果实特异表达启动子的pds 基因的植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明：番茄果实特异性表达pds 的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105 中,为下一步pds 在番茄果实中特异表达奠定了基础。