透性化植物乳酸杆菌细胞L-阿拉伯糖异构酶表观活力的研究

来源植物乳酸杆菌的L-阿拉伯糖异构酶(-Larabinose isomerase,EC 5.3.1.4.)是一种胞内酶,完整细胞呈现较低的酶活,而经过乙醇、乙醚、甲苯、曲拉通-100和CTAB处理的细胞酶活比完整细胞和超声波破碎的细胞表观酶活力均增加。甲苯透性化细胞优化条件:2%~5%甲苯浓度,15°C保温,作用5 min可得到最大酶活力9.3 U,比超声波破碎的细胞表观酶活力提高5倍。透性化细胞中L-阿拉伯糖异构酶60°C保温2 h,残余酶活80%,比超声波破碎抽提液中的酶对热更为稳定。用透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化半乳糖为塔格糖。     

嗜酸乳杆菌发酵法制备亚油酸异构酶的研究

以正交试验确定了嗜酸乳杆菌的最佳发酵条件，对其产生的亚油酸异构酶以硫酸铵分级沉淀和Sephadex G100层析进行了分离，并测定了酶活力。结果表明，嗜酸乳杆菌适宜发酵条件为：温度40℃，初始pH6．5，接种量1％，发酵时间24h；以上条件下产生的亚油酸异构酶经纯化后测得酶活为4358．6U。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力测定的研究

亚油酸异构酶能催化亚油酸转化为具有生理活性的共轭亚油酸。有关该酶活力的测定方法在国内外不同的文献中差别较大,尚没有统一的方法。本文对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力的测定方法进行了研究,以期为该酶分离纯化过程中酶活力的测定提供参考。通过单因素试验和正交试验,确定了该酶的最佳酶反应条件为:粗酶液添加量0.10ml,亚油酸0.70ml,Tween-802.00ml,反应温度37℃,反应时间3h。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及酶学性质研究

研究采用DEAE-Sepharose F.F离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对嗜酸乳杆菌发酵液中的亚油酸异构酶进行了分离纯化,酶回收率为6.39,纯化倍数为37.9倍。经研究确定酶最适pH为6.0,最适反应温度为30℃。在pH 6~8之间,亚油酸异构酶可保持较高活力,超出此范围,酶活力明显下降;该酶对高温敏感,50℃保温2 h,酶活力即变得很低;亚油酸异构酶受底物LA的抑制,酶反应最适LA浓度为1.5×10-5g/mL,过高LA则对酶产生抑制作用。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化研究

本实验对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化进行了研究。嗜酸乳杆菌的粗酶液经40%～80%饱和度的硫酸铵盐析、透析、SephadexG-100凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化后,酶的纯化倍数达到3.10,比活力为475.75U/(mg蛋白质);纯化后的亚油酸异构酶在SDS-PAGE电泳中只呈现一条带,并测得分子量约为46.6kDa。     

嗜酸乳杆菌亚酸异构酶提取方式的研究

共轭亚油酸是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸,亚油酸异构酶能特异性地转化合成CLA,克服了化学合成法的诸多缺点,但系统全面地研究胞内亚油酸异构酶破壁提取方式的很少.通过正交试验、方差分析等方法研究了嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的提取方式,确定了超声波法、化学法和溶茵酶法等的最佳提取条件和各影响因素的显著性,并对3种方法及复合法进行了比较.结果表明,溶茵酶法 超声波法破壁提取亚油酸异构酶效果最佳,酶活力最高可达82.6U.     

一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶的纯化及性质

亚油酸异构酶可以把亚油酸转化为共轭亚油酸。用硫酸铵沉淀、透析、凝胶过滤等步骤 ,从 1株嗜酸乳杆菌突变株中分离纯化了该酶。纯化倍数为 5 2 .0倍、比活力达 5 1 3 .0U/mg、活力回收 7.0 %。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 40 .7ku ;该酶的最适反应pH值为 4.0左右 ,最适反应温度为 3 0～ 40℃ ,在 pH 2 .0～ 7.0和 60℃以下较稳定。Fe2 + 、Mg2 + 、Zn2 + 、Na+ 能提高酶活性 ,Hg2 + 、Cu2 + 、Mn2 + 、Fe3+ 能抑制酶活性。以亚油酸为底物时该酶的动力学常数为 2 1 .6mmol/L。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的基因表达调控机制分析

对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的启动子区进行了定位,证明该基因为单顺反子结构。分析该酶的代谢途径证明亚油酸异构酶单独处于一条分支途径,无其他的酶与之协同作用。分析四种乳酸菌亚油酸异构酶基因的上游调控区,发现了12个保守位点,可能在亚油酸诱导基因表达调控中起重要作用。确定该蛋白N端无信号肽存在,但在N端25(27)～42位存在跨膜区,取向略微倾向于由外向内。证明嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的密码子偏好性与大肠杆菌的存在一定差异,可能影响亚油酸异构酶基因的表达,并提出了改造方案。     

一株嗜酸乳杆菌突变株转化亚油酸为共轭亚油酸条件的研究

以嗜酸乳杆菌为出发菌株，用紫外诱变方法，得到一株共轭亚油酸转化量较高的突变株，其转化亚油酸为共轭亚油酸的最佳条件为：反应温度35℃，pH值4．0，保温时间48h，亚油酸与培养液的比例为1000mg：100ml，在此条件下共轭亚油酸的产率达38．1％。在1mmol／L浓度下，Na^ 、Fe^2 、Mg^2 有助于提高共轭亚油酸的产量，而Hg^2 、Co^2 、Cu^2 、Mn^2 、Fe^3 不利于共轭亚油酸的合成。用超声波处理细胞后，共轭亚油酸的产率显著提高。     

透性化处理提高黑曲霉细胞α-葡萄糖苷酶的表观转苷活力

黑曲霉菌株D-597所产α-葡萄糖苷酶是胞内酶,完整细胞呈现的酶活力较低。研究了吐温-80、十六烷基溴化铵（CTAB）、乙醚、丙酮、戊二醛、乙醇等渗透剂的透性化效果,并对最适渗透剂戊二醛的透性化条件进行了优化,最优透性化处理条件为：每1g湿菌丝体添加30mL浓度为10%（v/v）的戊二醛溶液,处理温度30℃,处理时间60min。制备所得的透性化细胞的表观酶活达到483.9U/g湿菌体,是完整细胞表观酶活的193.3%。使用透性化细胞转化生产低聚异麦芽糖（IMO）,其转化周期为24h,较完整细胞缩短24h,转化率保持在70%以上,具有一定的工业化应用前景。     

Comparison of the effects of various attenuation methods on cell permeability and accessibility of intracellular enzymes in Lactococcus lactis strains

Three Lactococcus lactis cheese starter cultures were exposed to various cell attenuation methods including sonication, chemical treatments, heat-shock and freeze-shock. Treated cells were subsequently assessed for changes in cell permeability and accessibility to the intracellular peptidases Pep X and Pep N. Generally, for all three strains, as the duration of sonication increased, the levels of intracellular peptidases in the cell free extract increased. For the other treatments, cell pellets of strains were prepared and treated with isopropyl alcohol (IPA), sodium dodecyl sulphate (SDS), hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), heated over the range 45–65 °C or freeze-shocked using liquid nitrogen. The effects of various treatments on cell permeability were assessed using flow cytometry after staining with the Live/Dead^® BacLight? reagent kit. Treatment of cell pellets with CTAB generated a unique and highly permeabilized sub-population having the highest levels of accessible intracellular enzyme activity. Treatment with SDS also resulted in highly permeabilized cells and enhanced accessibility to Pep X or Pep N. The findings in this study are significant for the production of permeabilized L. lactis cell fractions having enhanced accessibility to intracellular enzymes.     

渗透化细胞转化生成苯乳酸的研究

Lactobacillus sp.SK007乳酸脱氢酶是催化苯丙酮酸转化生产苯乳酸的关键酶。实验中研究了渗透化剂对于Lactobacillus sp.SK007乳酸脱氢酶表观酶活的影响,优化了细胞渗透化处理过程;研究了pH和温度对于渗透细胞和粗酶液乳酸脱氢酶表观酶活及稳定性影响,优化了Lactobacillus sp.SK007渗透化细胞转化生产苯乳酸的工艺。渗透化过程:以2%乙醚为渗透剂,渗透时间2min,渗透化温度30℃;渗透化细胞转化生产苯乳酸工艺:苯丙酮酸底物浓度为5g/L,反应温度40℃,pH为6.0,转化时间为4h,PLA的产量达到3.38g/L。     

嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵条件的优化

采用Plackett-Burman试验设计从影响Lactobacillus acidophilus CICC6075产β-半乳糖苷酶的15个因素中筛选出3个显著因素,然后通过响应面分析法优化最佳发酵工艺参数,测定其在最适产酶条件下的酶活力。结果表明：影响嗜酸乳杆菌产酶的显著因素为发酵温度、酵母粉质量浓度和柠檬酸三胺质量浓度,其最佳工艺条件分别为36℃、6.22g/L、2.35g/L。在此条件下最高酶活力的预测值为3.95U/L,与实测值(3.98U/L)十分接近。本实验利用优化工艺发酵产酶,酶活力提高了近两倍。     

Preparation of high-activity whole cell biocatalysts by permeabilization of recombinant yeasts with alcohol

Recombinant yeast cells intracellularly overexpressing three different enzymes were permeabilized with alcohol under various conditions. The effects of enzyme stability in alcohol and enzyme molecular weight on the activities of permeabilized cells and enzyme leakage during incubation were examined. Saccharomyces cerevisiae YPH250 overexpressing glyoxalase I (GloI), S. cerevisiae MT8-1 overexpressing isocitrate lyase (ICL), and Pichia pastoris GS115 overexpressing beta-galactosidase (beta-gal) were used as model recombinant yeast systems. In all cases, the percentage of alcohol used for the treatment significantly affected the activity of permeabilized whole cell biocatalysts; cells showed high activity when treated with 40% isopropyl alcohol. The activity of whole cell biocatalysts was also significantly affected by the stability of the enzyme in alcohol solution; permeabilized yeast cells overexpressing ICL, which had low stability, showed rather low activity. Although the enzyme leakage from permeabilized cells was rather low in all cases, the molecular weight of the enzyme appeared to affect the extent of enzyme leakage during incubation. Permeabilized cells of P. pastoris overexpressing beta-gal (540 kDa) retained particularly high activity during incubation and could be used as an immobilized whole cell biocatalysts.     

产酶培养条件对一株嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力的影响

本实验用MRS培养基嗜酸乳杆菌,并通过添加亚油酸(LA)诱导其产亚油酸异构酶。单因素试验结果表明,在MRS培养基中添加糖类物质总体上不利于产酶,添加尿素、牛肉膏、酵母膏、酪蛋白等有机氮源后,酶活力比对照组有较大幅度提高,而添加无机氮源酶活力增加幅度不如有机氮源。在培养基中添加一定量的NaCl和卵磷脂也有助于酶活力的提高。由正交试验结果确定的最佳产酶条件为:培养温度37℃,培养时间24h,每100ml培养基中添加10mgLA,接种量3%(V/V)。     

嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明：嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46 倍和10.82 倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。     

复合乳酸菌在发芽糙米乳中的发酵特性

将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌4种乳酸菌经三三组合后作为复合发酵剂对发芽糙米乳进行发酵,通过分析酸度、活菌数、脱水收缩作用敏感性、蛋白质分解力、流变学性质等实验结果,对各乳酸菌组合的发酵特性进行评价,最终筛选出适合发酵发芽糙米乳的最佳菌株组合。结果表明:植物乳杆菌-嗜酸乳杆菌-干酪乳杆菌组合所得到的发酵发芽糙米乳具有较高的品质。该发酵糙米乳在4℃条件下贮藏21 d后酸化程度较弱,下降了0.71个单位;活菌数变化小且冷藏期间数量一直高于8.7(lg(CFU/m L)),游离氨基酸平均含量达0.86 mmol/L,流变学性质显示其剪切稀化作用较弱。故该乳酸菌组合较为适合发酵发芽糙米乳。     

菊粉寡糖促进嗜酸乳杆菌生长的研究

对菊粉可促进嗜酸乳杆菌的生长进行了初步研究。结果表明 ,用菊粉代替培养基中部分葡萄糖 ,嗜酸乳杆菌的生长得到明显的促进 ,当MRS培养基中葡萄糖与菊粉的质量比为 1∶1时 ,嗜酸乳杆菌的生物量及酸度得到提高 ,在 3 7℃下培养 48h ,活菌的数量及酸度比对照组分别提高 1 0 10CFU/mL和 1 0°T。