β-1,4-葡聚糖内切酶egl3基因在乳酸乳球菌中分泌表达的研究

研究采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36eusp45-egl3及重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3,分析了重组乳酸乳球菌表达β-1,4-葡聚糖内切酶的效果及其降解滤纸和小麦秸秆的能力。结果表明,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3经28h培养能胞外分泌酶活为1 016U/L的β-1,4-葡聚糖内切酶,有效地降解了羧甲基纤维素钠。在30℃恒温培养10d时,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3降解滤纸和小麦秸秆为其提供发酵底物,分别产生乳酸2.55g/L和6.95g/L,pH分别降至5.10和4.84,干物质降解率分别为4.22%和29.36%。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用

目的:镉(Cd)是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法:构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白(GST-SUMO-MT)的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd~(2+)和Zn~+的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌(2×10~9~2×10~(11)CFU/d)及CdCl_2溶液[5mg/(kg·d)],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果:获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd~(2+)、Zn~(2+)能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd~(2+)在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论:为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。     

猪链球菌口服疫苗的制备及小鼠血清免疫效果的评价

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)新型疫苗,给猪链球菌病的防治提供新思路,首先在大肠杆菌中表达猪链球菌毒力因子EF和MRP,以His-tag柱纯化重组蛋白,并制备EF和MRP鼠源多克隆抗体。随后将ef和mrp基因置于组成型启动子P59和信号肽Usp45下,克隆到乳酸菌表达载体pMG36e上,电击转化到干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC27092中进行表达。Western blot检测显示EF和MRP蛋白均能在乳酸菌中成功表达,且EF蛋白的表达量随着重组菌生长时间的增长而增大,而MRP蛋白的表达量在重组菌生长到OD600为0.8时达到最高,随后慢慢下降。用含有表达EF和MRP蛋白的重组干酪乳杆菌喂饲C57BL/6J小鼠,发现重组菌可在小鼠体内存活2d左右,并可有效刺激小鼠产生EF和MRP特异性抗体,为研制乳酸菌口服疫苗防治猪链球菌病的可行性进行了有益的探索。     

牦牛源产细菌素的乳酸菌的筛选鉴定

为筛选优良的产细菌素乳酸菌,用含0.5%碳酸钙的MRS固体培养基从19份牦牛粪便样本中分离出91株乳酸菌,进一步采用牛津杯法筛选产细菌素的乳酸菌,并结合16S rRNA序列扩增测序鉴定该批乳酸菌.结果表明:在排除有机酸、过氧化氢等抑菌因素后,从91株乳酸菌中筛选到9株对大肠杆菌ATCC25922和金葡球菌ATCC25923有明显抑制作用的乳酸菌菌株,该9株菌株对蛋白酶敏感,初步认定为产细菌素乳酸菌;经16S rRNA序列扩增测序鉴定该9株菌分别为海氏肠球菌,屎肠球菌,蒙氏肠球菌株和植物乳杆菌,其对常见抗生素不耐药,可作为益生菌的候选菌株.     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

发酵罐中蔗糖流加控制和pH调控对乳酸链球菌素产量的影响

主要研究了乳酸乳球菌发酵过程中调控pH和补加蔗糖对乳酸乳球菌发酵生产及其发酵产物乳酸链球菌素效价的影响,通过将pH恒定为乳酸链球菌素产生的最佳值6.8,与不经过pH调控的乳酸乳球菌发酵生产的乳酸链球菌素效价对比,效价提高了1.2倍。分别选用2g/L·h和4g/L·h的蔗糖流加速度,当按4g/L·h恒速流加蔗糖溶液时,乳酸链球菌素效价提高约50.5%。     

虾夷马粪海胆硬脂酰辅酶A去饱和酶和蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆与表达

采用同源克隆方法,结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-coenzyme A desaturase,SCD)基因和蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)基因,并对其结构进行了分析,同时采用实时定量PCR方法对这两个基因在海胆胚胎不同发育时期的表达进行了研究。结果表明:SCD基因的cDNA序列全长为1 934bp(Genbank登录号为HM208174),开放阅读框819 bp,编码273个氨基酸残基,存在跨膜结构和信号肽,为分泌性蛋白;实时定量PCR检测显示,SCD基因在虾夷马粪海胆八腕期表达量最高,在2细胞时期表达量最低。PTP1B基因的cDNA序列全长为1 249 bp(Genbank登录号为HM208173),开放阅读框657 bp,编码219个氨基酸残基,存在跨膜结构和信号肽,为分泌性蛋白;PTP1B基因在海胆2细胞时期表达量最高,在八腕期表达量最低。本研究为在分子水平上探讨海胆脂代谢过程中的基因功能提供了科学依据。     

藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析

为解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及其基本生物学特征,无菌采集12头健康藏绵羊新鲜粪便,分离培养及纯化乳酸菌株,并通过16S rDNA序列扩增和测序进行分子鉴定.结果显示:从12个样本中共分离纯化出19株乳酸单菌,分属于7个属,其中鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌及植物乳杆菌所占分离比例较多.该结果为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群种类及藏绵羊益生菌制剂的开发提供了基础.